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其它 绿色荧光蛋白EGFP表达的检测 点图去除细胞碎片 直方图检测荧光强度 FL-1通道 Thank you * * * 荧光补偿 细胞分选 细胞的分选是通过流束形成含有细胞的带电液滴而实现的。在流动室的喷嘴上装备有一个超声振荡压晶体片，这个振荡装置使自喷嘴射出的液束破碎成千万个小滴，流动的细胞就被分散在这些小水滴中。这时给流束一个电脉冲信号，使小水滴就全部带上电荷。当带有不同电荷的细胞液流经一对带正、负几千伏恒定静电电场的偏转板时，带电的小水滴就根据自身所带的电荷性质产生偏转，落入各自的收集容器中，不带电荷的水滴就进入中间的废液容器中，从而实现了细胞的分选。  A leading supplier for multi-color assays for flow cytometry and reagents for immunological assays 流式细胞术的应用 淋巴细胞亚群分析 细 胞 凋 亡 细胞增殖 表面抗原的检测 流式科研应用 膜电位 其它 细胞凋亡 外源性途径:通过细胞外信号激活细胞内的凋亡酶Caspase 内源性途径:通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase 活化的caspase可以将细胞内重要的蛋白降解,引起细胞凋亡 检测方法 外源性启动信号包括受体的配体,如TNF-Fas Ligand ;跨膜蛋白Granzyme B 颗粒酶B;非蛋白激活物Ca2+ 射线 内源性信号反应性氧ROS可以特征性的引起细胞内损伤而诱发发生在线粒体膜上的凋亡 典型特征 1.线粒体膜电位的丧失 2.细胞膜PS磷脂酰丝氨酸的外翻 3.细胞核凝固缩和断裂 细胞膜检测方法 PS磷脂酰丝氨酸的外翻Annexin V fl-1 细胞膜的完整性 PI 7-AAD fl-3 细胞膜PS磷脂酰丝氨酸的外翻相关凋亡事件 细胞凋亡早期事件, PS暴露在细胞膜外,Annexin V 分子量35-36KD的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,与PS亲和力高Ka=10-10 ,Annexin V 被标记如FITC,PE.特点快,准确. Annexin V-FITC /PI双染可区分凋亡,坏死和正常细胞.凋亡细胞膜完整,坏死细胞膜破碎. PI可嵌人DNA的红色发光物质,不能通过完整的细胞膜,但是可以进入坏死细胞 Time Course of TRAIL Induce Jurkat Cell Apoptosis Dose Course of TRAIL Induce Jurkat Cell Apoptosis 细胞核相关凋亡检测 凋亡峰(DNA小片段峰)的检测DNA Ladder PI, 7-AAD TUNEL法 细胞周期 DNA含量 0 200 400 600 800 1000 PI 荧光强度(DNA含量) DNA含量分析(PI法) 2N 4N Counts G0/G1 G2/M S 异倍体 DNA断裂 TUNEL 法 DNA断裂在凋亡初期形成200-250kp或30-35kb的大片段 晚期进一步在核小体间断裂,形成180-200bp的DNA断裂碎片 TUNEL(TdT mediated Dutp Nick End labeling) : 不依赖模板的方式在双链或单链DNA的离3-OH末端将dUTP逐个加上 底物可以是 dUTP或BrDU(无或有荧光标记) 显示凋亡时DNA断裂的程度 直方图 Caspase相关检测 Caspase 抑制性底物如DEVD,VDVAD,IEHD,LEHD,VAD上标记FITC绿色或sulfo-rhodamine红色成为FITC-多肽-FMK或sulfo-rhodamine-多肽-FMK,标记物细胞膜通透性很好且无毒,在细胞凋亡中可与活化的Caspase不可逆的结合,反映活化的Caspase的量 线粒体相关检测 JC-1该染料很容易进入正常细胞的线粒体中并以多聚体的形式存在,发出红色荧光,凋亡细胞中线粒体膜电位崩溃,此染料无法聚集在线粒体中,只能以单体的形式存在细胞质中,发出绿色荧光,红绿荧光可以区分出正常和凋亡细胞 FL-1通道检测 峰图 细胞色素C释放来检测 ADP/ATP比列 增殖细胞ATP水平高,凋亡细胞ADP水平提高,ATP水平下降,坏死细胞更显著 luciferin+ATP+O2 Oxyluciferin+AMP+P+light 谷胱甘肽 细胞凋亡早期GSH水平下降 GSH用来清除ROS NO检测 凋亡细胞中NO合成的速度远高于正常细胞 Luciferase,Mg2+ 细胞增殖 CFSE 一种荧光染料,能跟细胞骨架蛋白结合.细胞先用过量的CFSE染