基因组作图()解说.ppt

基因组计划的基本目标 获得全基因组顺序，在此基础上再对所获得的序列进行解读。获得基因组顺序的主要方法是进行DNA测序，然后再将读取的顺序组装。目前的DNA测序每次反应仅能读取不到1000bp的长度，因此基因组测序的第一步是构建基因组图，然后将基因组区段分解逐个测序，最后进行组装。 基因组作图的基本构想是，在长链DNA分子的不同位置寻找特征性的分子标记，根据分子标记将包括这些序列的克隆进行连锁定位，绘制基因组图。一旦构建好基因组图，即可着手进入全基因组测序。 什么是鸟枪法 全基因组随机测序战略主要采用鸟枪法（shotgun）。鸟枪法，也俗称“霰弹法”，是随机先将整个基因组打碎成小片段进行测序，最终利用计算机根据序列之间的重叠关系进行排序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置 “鸟枪法”优点是速度快，简单易行，成本较低，可以在较短的时间内通过集中机器和人力的方法获得大量的基因片断 但是用它来测序，最终排序结果的拼接组装比较困难，尤其在部分重复序列较高的地方难度较大。此外有许多序列片段难以定位在确切的染色体上，成为游离片断；同时又会有许多地方由于没有足够的覆盖率而形成空缺。这些缺陷最终导致整个基因图会留下大量的空洞（gap），也影响其准确度 重叠群法 以大片断定位的克隆为基础的定向测序战略主要采用克隆步移法或称重叠群法： 先构建遗传图，再利用几套高度覆盖的大片段基因组文库（BAC、PAC等）获得精细的物理图，选择合适的BAC或PAC克隆测序，利用计算机拼装。BAC内的空洞基本上都可以利用设计引物等手段填补，形成一条完整的BAC序列。然后由相互关联、部分重叠的BAC克隆连成一个大的重叠群（Contig）。理想状况下，整条染色体就是由一个完整的重叠群构成。 重叠群法 利用克隆步移法测序，国际上通行的标准要求BAC测序达到十倍覆盖率，使所测的序列达到99.99％以上的准确度。该方法的技术难度较高，尤其大片段基因组文库（BAC）和精细物理图构建是技术性极强的工作。 此外，费用相对于鸟枪法要稍高一些，完成整个基因组测序周期也要长些。但是，通过这种方法得到的基因组数据是最为准确和精细的数据，也是基因组测序的最终目标。大基因组“完成图”目前大多都是通过这种方法获得的。基因组“完成图”，即完全覆盖所测物种的基因组、准确率超过99.99％的全DNA序列图。“完成图”的覆盖率接近100％，准确率更高，达到99.99％。 遗传作图中DNA标记的发展 遗传标记的发展： 第一代标记 经典的遗传标记（蛋白质和免疫学的标记） 70年代中后期，限制酶片段长度多态性（RFLP） 第二代标记 85年，“小卫星序列（minisatellite） 89年，“微卫星序列（microsatellite） 第三代标记 单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphism ，SNP） 遗传作图中的第一代DNA标记 现代遗传图谱的概念由Botstein D等(1980)首先提出，在此基础上，限制性片段长度多态性（RFLP）作为遗传图谱的第一代崭新标记得以问世 。 限制性位点能够用作基因标记。广泛应用到基因组研究中。基因或基因组可以用重叠的限制性片段来作图。最终扩展到整个序列，构建连锁图谱 同源染色体同一区段DNA 序列的差异， 限制酶识别的碱基顺序有专一性 遗传作图中的第二代DNA标记 简单序列长度多态性 SSLPs 发现： 小卫星序列minisatellite （1985年） 微卫星序列microsatellite （1989年） microsatellite marker又称简单串连重复（short tandem repeat，STR），最重要的优点是高度多态性，提供的信息量相对很大；另外可用PCR技术使操作实现自动化，遗传图与物理图研究中非常有用的工具 20世纪80年代后期,人们开始应用微卫星序列(microsatellite,MS)绘制图谱。1994年底，美、法完成了以RFLP及微卫星ＤＮＡ为标志的遗传图谱.图谱包含了5826位点，覆盖4000cM，分辨率高达0.7cM．1996年法国报道了完全以微卫星DNA标志构建的遗传连锁图，包含2335位点，分辩率为1.6cM 遗传作图中的第三代DNA标记 单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphisms，SNPs） 点突变，位于密码子的摇摆位置，表现为沉默突变而被大量保留下来。大多数不能被限制酶识别，必须采取测序或寡聚核苷酸杂交检测 在人类基因组中可达到300万个，平均每1000个碱基对就有一个 数目多，覆盖密度大，它的开发和应用摒弃了遗传标记分析技术的瓶颈凝胶电泳，为DNA芯片技术应用于遗传作图提供了基础 三、基因组作图的方法 遗传作图 物理作图