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酶制剂生产技术模块二 酶的发酵生产 生物化工学院 兰欣 引入-动植物细胞大规模培养的意义 概念：动植物细胞培养是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。 （组织培养：组织或细胞在体外培养使之生存和生长，并保持组织分化、组织结构和功能。） 意义：虽然微生物的培养已经用来生产大量的对人类有益的产品，但是动植物细胞的大规模培养可以获得一些微生物培养所不能得到的重要的酶制剂产品。 特点：1、对环境条件要求高，对环境变化反应十分敏感；2、对营养素要求严格；3、生长相对缓慢。 学习情境八 细胞培养产酶 工作任务 （一）动植物细胞的特点 工作任务 （二）植物细胞培养和发酵 工作任务 （三）动物细胞发酵产酶 动植物细胞培养和微生物培养的比较1 动植物细胞培养和微生物培养的比较2 7.3 植物细胞培养简介 植物细胞培养流程 第二节 植物细胞的形态及生理特征 一、植物细胞的形态 二、植物细胞的结构特征 第三节 植物细胞的培养 植物细胞培养从植物组织培养而来，植物组织培养主要用于形成组织和再生成植株 细胞培养主要生成次生代谢产物 基本技术： 植物材料的准备 培养基制备 培养方法的选择 常用培养基 MS、N6、B6、LS、RM-1964、H、T、B5、DBMII、米勒、改良怀特、尼许等。 MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，能保证组织培养生长所需的矿物营养。并且因为离子浓度高，在配制、贮存、消毒过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响培养基中的离子平衡。 植物细胞生物反应器 植物细胞易聚集，较脆弱，代谢途径和代谢产物累积与细胞生长关系复杂，选择合适的培养方法和反应器 细胞培养周期长，次生代谢产物含量相对较低，提取困难，生物反应器技术还有待深入 植物细胞生物反应器 主要有五种类型 1.机械搅拌式生物反应器：对搅拌器加以改进。 优点：反应器内的温度、pH、溶氧及营养物质浓度较其他反应器更易控制。 2.鼓泡塔式生物反应器:通过位于底部的喷嘴及多孔板而实现气体分散。 优点：没有运动部件，操作不易染菌，在无机械输入情况下，提供较高的热量和质量传递，适于对剪切力敏感的细胞的培养，放大相对容易 缺点：流体流动形式难以确定，混合不匀，缺乏相关数据。 3.气升式生物反应器 优点：结构简单，没有泄露点和死角，可以在低剪切力下达到较好的混合和较高的氧传递效果，不易污染，操作费用很低。 缺点：高密度培养时混合不够均匀。 4.转鼓式生物反应器：通过转动促进反应器内的氧及营养物的混合，设置挡板有助于提高氧的传递，在高密度培养时有高的传氧能力。 缺点：难于大规模操作，放大困难。 △5.固定化生物反应器:前体是细胞的代谢产物必须分泌到细胞外。 优点：可保护细胞免受剪切力； 细胞可长时间重复使用 易于实现细胞的高密度培养 细胞间接触良好，易于分化，有利于次级代谢产物的合成 减少细胞的遗传不稳定性 易于实现连续化操作 植物细胞培养类型  工作任务 （三）动物细胞发酵 1、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物，特别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。 由动物细胞培养生产的酶有胶原酶，血纤蛋白溶酶原活性剂等。 2、动物细胞培养方法： 悬浮培养；固定化细胞培养 3、动物细胞发酵工艺条件的控制 有关概念 原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。 细胞计数原理 细胞计数操作步骤 1、将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 细胞活力测定步骤 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。 在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。 目前可