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9.解决方案 所制的胶不平 玻璃没有洗干净，应该要洗得非常干净。 过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平。 加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。 稍微注意手法，均匀加入。 灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面。边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加无水正丁醇覆盖，浓度越低的胶越不要使用双蒸水压。 胶凝时不可加热。 漏胶 每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。 避免玻璃边缘（与胶条接触处）的破损。 找一块很平的桌面制胶。 胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。 可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部涂抹凡士林封。 两块玻板完全对齐。 条带跑得比正常的窄 可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀。 可能与拔梳子有关，拔梳应该迅速，均匀用力。 等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调整电压。 可能是样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带走的较慢。 每孔上样量不均匀，应确保每孔中上样量一致。 可能是系统的ph出了问题，有可能是电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液。 “微笑” “微笑”是因为灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。 “倒微笑“也称“皱眉”现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象 样品中盐浓度过高。 点样量太多或每孔点样量不均匀。 电泳电压不稳定或过高 。 在空的加样孔加入1×Loading Buffer。 转膜缓冲液过热 缓冲液离子强度太低。 或电压及电流过高。 更换新的缓冲液。 注意转膜时的降温。 背景过高 封闭不全。 一抗或者封闭液与膜蛋白的交叉反应。 一抗或二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。 抗体浓度太高，或孵育时间太长，室温孵育一抗可能遇到这种情况。 曝光时间的控制。 没有信号 用单抗时比较容易出现这种情况。 蛋白的表达量。 蛋白转膜效率。 一抗二抗的效价问题 。 微笑 微笑 气泡 非特异条带 胶不均匀 胶不均匀 胶不均匀 黑膜 曝光过度 不同曝光时间 胶片重叠后曝光 胶片重叠后曝光 胶片重叠后曝光 试剂配制 1×Tris-Glycine Buffer 1L Tris 3g Glycine 14.4g SDS 1g 1×转印缓冲液 1L Tris 3g Glycine 14.4g 甲醇 200ml 试剂配制 抗体去除液 Glycine 7.5g SDS 0.5g Tween-20 5ml 用浓盐酸调节pH=2.2 请各位老师同学批评指正！ 2012-06-28 Western Blot 实验步骤及注意事项 Western Blot 实验步骤及注意事项 制样 SDS凝胶的配制 上样与电泳 转印 封闭 抗原抗体反应 显影 膜的重复利用 解决方案 1.制样 1.所有离心均在4℃进行，所有操作均在4℃进行，需使用的离心管4℃预冷。 2.从培养箱中取出处理后的细胞，置于4℃，吹打/刮去/消化收集细胞，转移至15ml离心管，500g, 4℃,7min。 3.弃上清， 4℃预冷的PBS重悬细胞，转移至1.5ml离心管，500g, 4℃,7min。重复一次。 4.弃去上清，吸干。按细胞量不同加入100μl~ 200μl含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液。吹匀细胞， 4℃裂解15min~30min。 1.制样 5.裂解后超声裂解1min (超声5s,间隔10s) ,起沫即可。 6.离心，12000g, 4℃,10min。 7.上清转移至新的1.5ml离心管，蛋白定量，各样品调整至统一的浓度。加入6×Loading Buffer，使Loading Buffer浓度稀释至1×，混匀，煮沸8~10min。 8.待样品冷却，短时离心，密封储存，-20 ℃或-80 ℃。 1.制样,方案二 21.6孔板置于冰上，转移培养基至15ml离心管。 4℃预冷的PBS洗涤6孔板，洗涤液收集于同一个15ml离心管。重复一次。 22. 500g, 4℃,7min，弃去上清。 23.吸净离心管和6孔板的液体，按每孔80μl~ 100μl含抑制剂的裂解液，重悬后转移至6孔板，冰上静置5min。 24.刮去细胞，转移至1.5ml的离心管中，吸尽，稍震，冰上静置30min。 25.之后安上一方案5~8步进行。 1.制样,注意事项 1.尽量缩短操作时间，所有操作在4℃进行，离心机提前预冷。 2.加裂解液前，应把液体吸尽，可静置/离心后再吸一次。 3.裂解液的量应以能完全裂解细胞为宜，不宜过多，加入裂解液后应