TNF的诱生与检测解说.pptVIP

细胞因子的检测方法 左大明 zdaming@ 细胞因子 一类由细胞分泌，具有多种功能的高活性小分子蛋白，参与免疫调节和多种生理病理过程等。 白细胞介素(interleukin, IL) 干扰素(interferon, IFN) 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF) 集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF) 生长因子(growth factor, GF) 趋化因子(chemokine) ELISPOT(酶联免疫斑点实验) ELISPOT技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子的特异性抗体，在分泌细胞周围直接扑获待检细胞因子。实验中每个斑点（spot）是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。它可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力。 优点：灵敏度高，是目前为止最灵敏的检测技术。可检测到百万分之一阳性细胞率; 单细胞水平、活细胞功能检测; 操作简便，可进行高通量筛选。 应 用 移植研究--allograft rejection 疫苗开发--亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响 Th0/Th1/Th2细胞转换分析 自体免疫研究--免疫调节及免疫治疗研究 癌症研究--肿瘤反应T细胞作用 过敏机制探讨--IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与过敏机制之细胞因子的研究 传染疾病研究--Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, 等 * 优点：敏感、可靠； 缺点：需长期饲养细胞、检测耗时长、步骤繁杂。 1 不同的CK具有不同的生物学活性，选择CK独特的生物学活性，即可检测。 细胞增殖/抑制实验 细胞病变抑制实验 细胞毒实验 细胞趋化实验 。。。 生物学检测法 细胞因子的检测方法 2 利用抗体对抗原表位的识别，测定的是可溶性细胞因子的抗原性。 ELISA RIA FIA ELISPOT 。。。 免疫学检测法 优点：方便、迅速 缺点：价格昂贵，结果仅代表CK的量而非活性，敏感性较低。 3 利用基因探针，检测特定细胞因子基因表达，即mRNA水平。 斑点杂交 Northern印迹 细胞和组织原位杂交 RT-PCR 。。。 分子生物学检测法 局限性：仅能检测基因表达情况，不能直接提供有关细胞因子的浓度和活性，只用于机制探讨。 待检样品(细胞上清) 指示细胞（CTLL-2） IL-2依赖细胞系 按不同稀释度加入 37oC，16-20小时 加入3HTdR（1-5?Ci） 37oC，4-6小时 收集细胞 测定 细胞增殖实验 细胞病变抑制实验 待检样品（细胞上清） IFN-?指示细胞（wish） 按不同稀释度加入 37oC，4小时 37oC，24-48小时 弃取上清，加入VSV(水泡性口炎病毒) 观察细胞病变（镜检或比色） 计数受趋化细胞 趋化因子 细胞 趋化实验示意图 微孔滤膜 用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。 免疫标记技术 高通量细胞因子检测 CBA (Cytometric Bead Array)是一种微珠多用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而且可以得到一个样本的多个数据。 CBA原理示意图 1.特异性单抗包被在培养板孔底部； 2.封闭能结合单抗的其他部位； 3.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞分泌的细胞因子被单抗捕获； 4.移出细胞，洗涤； 5.加入生物素标记的二抗； 6.加入酶标链霉亲和素； 7.加入显色底物，在酶的催化分解下，产生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点； 8.斑点计数（可人工计数，也可用自动读板仪计数），数据处理，结果分析。 ELISPOT Medium PHA Peptide 1 Peptide 21 Peptide 47 GzB HIV- peptide recall patient B IFN- g HIV-peptide specific recall response shows dissociated production of IFN- g and GzB Kleen T. et al, AIDS 2003, 18: 383-392 TNF-?的诱生和检测 主要由单核/巨噬细胞及其他多种细胞产生，能使