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第四章 基因和基因组 §4.3 目的基因 Mamam-Gilbert化学降解法Sanger 双脱氧链终止法 Mamam-Gilbert化学降解法基本原理 一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解 其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基 因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。 每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。 此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。 G反应：硫酸二甲酯（DMS）使G在中性和高温条件下脱落。 G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。 T+C反应：肼（低盐） C反应：肼（高盐） 测定DNA长度~250bp Sanger双脱氧链终止法基本原理 在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端’使引物延长’合成出新的互补的DNA链 如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP) 由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。 由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。 与 PCR反应类似。 反应体系中包含：模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物； 反应过程： 变性－复性－延伸－终止 Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸） ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制 一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。 反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般1：3~4) Sanger第一步：加入复制终止剂 Sanger第二步：荧光检测 Gel Electrophoresis DNA Fragment Size Determination DNA 带负电 DNA在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关 Analyzed Raw Data 除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。 Trace diagrams are analyzed by base calling programs that use dynamic programming to match predicted and occurring peak intensity and peak location. Base calling programs predict nucleotide locations in sequencing reads where data anomalies occur. Such as multiple peaks at one nucleotide location, spread out peaks, low intensity peaks. 基因组文库与cDNA文库 基因组文库： 用克隆的方法将一种生物的基因组长期以重组体的方式保持在适当的宿主中 cDNA文库： 将获得的mRNA反转录成cDNA后克隆形成的文库 一、物理法获得目的基因 限制酶切或机械破碎 离心分离 AT/GC碱基对密度有差异 实例：海胆组蛋白基因、 苏云金杆菌晶体蛋白 多角病毒多角体蛋白 二、化学合成目的基因 根据基因表达产物的氨基酸顺序推测基因的核苷酸序列，然后先合成一个个含少量核苷酸的DNA片段，再利用碱基对互补关系使它们形成双链DNA片段，再用连接酶把小的双链DNA片段逐个按顺序连接起来，使双链逐渐加长，最后得到一个完整基因。 目前仅限于合成核苷酸对较少的一些简单基因 优点，就是可以人工合成自然界不存在的新基因。 三、从基因文库中提取目的基因 四、利用PCR法扩增目的基因 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 PCR的基本原理 类似于DNA的体内复制 首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC) PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm )