第九章原生质体培养与体细胞杂交教材.ppt

* 物理选择法 利用原生质体的大小、颜色、漂浮密度等差异进行选择 。 * 形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。 五、体细胞杂种植株的鉴定 * 杂种细胞的染色体数应该是双二倍体；利用染色体显带技术，以亲本染色体为对照，对细胞杂种的染色体数目、形态和带型进行观察。 细胞学鉴定 * Somatic hybrids have ALL of the chromosomes from each parent plant * 根据亲本和杂种同功酶谱的差异来鉴别杂种。有的呈双亲谱带的总和、有的出现新谱带或丢失部分亲本谱带。 同功酶鉴定 * 分子生物学鉴定 在DNA水平上对亲本和杂种植株遗传差异进行鉴定的一种技术。 THE END * * The different protoplast culture techniques (modified from Matsumoto and Oka 1998). * * * 胞质体，对细胞用细胞松弛素B处理后,离心去除细胞核,剩余的细胞结构. 为实现油菜细胞质基因组杂交，武汉大学杨弘远等利用吖啶橙结合光照处理，造成了核不可逆失活，从而可以认为其原生质体为胞质体。 * 一般叶片只用纤维素酶和果胶酶, 悬浮细胞一般还会加入半纤维素酶. * 加入缓冲剂如MES（乙基磺酸）对保持酶解物的酸碱环境起缓冲作用 * 盐类可以提高质膜的稳定性，增加完整原生质体的数量和活力。 一般情况下,叶片原生质体用甘露醇、山梨醇，而悬浮细胞用葡萄糖 * 盐类可以提高质膜的稳定性，增加完整原生质体的数量和活力。 子叶、叶片、下胚轴：较易酶解，选择活性中等的酶如onozuka r-10, macerozyme r-10，低浓度处理，时间略短 愈伤，悬浮细胞等：较难酶解，选择活性较强的酶如onozuka RS pectolyase Y-23, rhozyme HP-150，时间延长 * 首先将酶解混合物过一定孔径的筛网（40-100目）去除未消化的大的细胞团和组织块等较大的杂质，收集滤液，进行以下纯化方法。 过滤离心法应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部. 漂浮法应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。 * 纯化的原生质体需经活力测定后方可用于培养。 * 一般认为原生质体培养基中的大量元素应比愈伤组织培养基中的浓度底。在大量元素中，对原生质体培养效果影响最大的是Ca2+和氮源的种类。由于钙能保持原生质体质膜的稳定性，因此，较高浓度的钙对原生质体的分裂是有利的。 一般来讲，丰富的有机物质的培养基有利于细胞胞分裂，如KM8P培养若的有机成分较高，因此在原生质体培养中得到了广泛应用，并在许多研究中取得了好的成果。 不同植物种的原生质体培养，对激素的种类和浓度的要求存在较大的差异，甚至同种植物不同细胞系来源的原生质体培养，对激素的要求也不尽相同。但总的说来，生长素和细胞分裂素是必须的 原生质体培养基的pH一 般为5.5-5.9, * 原生质体的初始植板密度对原生质体的培养效率有显著的影响, 适宜的密度范围内,原生质体易于分裂增殖.当原生质体密度过高时,往往会由于养分不足或细胞代谢物过多而妨碍再生细胞的正常生长.如果密度过低,原生质体的再生细胞一般不能持续分裂 * 1978年德国科学家梅歇尔斯将番茄与马铃薯进行体细胞杂交育成薯番茄“ 体细胞杂交育成薯番茄“泡马豆”（po(tato)-(to)mato）。马铃薯与番 (to)mato）。马铃薯与番茄两种原生质体的融合率竟高达40％～50％。 * 仅限于同一物种内。 * 1970年，Power首次用硝酸钠为诱导剂进行了较大规模的原生质体诱导融合； * Kao等(1974)发现，用含有高浓度Ca＋2(0.05 mol／L CaCl2·2H20)的强碱性溶液(pH9－l0)清洗PEG，比用培养基清洗能 产生更高的融合频率，从而将PEG融合法与高Ca＋2－高pH融合法结合在一起，建立了PEG－高Ca＋2－高pH融合法。 * * 脉冲次数要适当，次数过多容易造成多个细胞的融合，同时也会造成膜的过度伤害而不能修复。 * 因融合的随机性而成为细胞融合的关键而必需的技术 * Lycopersicon esculentum番茄 ； solanum bulbocasanum土豆（有球茎的茄属植物） Mint 薄荷 * 鉴 定 体细胞杂种的常用方法有形态学比较和同工酶分析， 这两种方法简便、易行， 但在亲缘关系较近的种间融合杂种的鉴定上有些困难， 在再生植株的早期， 也不易通过形态学特征进行鉴别．要获得体细胞杂种最直接的遗传证据必须进行D N A遗传分析． RFLP(Restriction Fragment Length P