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Western blot 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 在电场的作用下，将电泳分离的蛋白质混合物从凝胶转移至固相支持膜上，再利用某种蛋白（目的蛋白，如GAPDH）的特异性抗体来对其进行鉴定，可进行定量分析。 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理：SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用，由于 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道, 所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。 ECL发光 1、倒掉洗膜液，将PVDF膜夹于吸水纸中间，吸去多余液体，转膜时与胶相邻的一面向上，铺于玻璃板上； 2、将ECL试剂盒内的detection reagent 1与detection reagent 2等体积混合后，均匀滴在PVDF膜上，反应1分钟 3、夹起PVDF膜，用吸水纸中吸去多余液体； 4、用保鲜膜包好PVDF膜，固定于片夹内，准备曝光； 洗片 5、裁好底片，大小与膜相当，压片； 6、显影3分钟，水中漂洗几次，定影10至15分钟，清水冲洗； 7、根据显影效果，确定下一张片子的曝光时间； 8、分析结果。 * * 背 景 Western Blot的基本原理 Western Blot的一般流程 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 实验目的及进度安排 实验目的：利用蛋白印记法检测大鼠脑组织中β-actin的表达 进度安排： 蛋白样品制备，蛋白定量标准曲线，SDS凝胶的制备 蛋白样品SDS凝胶电泳，转膜，封闭，一抗过夜杂交 二抗杂交，Western-ECL 蛋白样品制备 实验原理：利用SDS等去垢剂破坏细胞的膜结构，细胞内含物（主要是蛋白质）释放出来，常用RIPA buffer等裂解液，在此裂解条件下DNA一般形成沉淀，蛋白质溶于上清中。 注意事项：全部操作需在冰上进行；需要加蛋白酶抑制剂； 实验步骤： 1、加入500ul的RIPA buffer，用注射器反复吹吸，冰上孵育30分钟； 2、10,000g，4℃离心10分钟，转移上清（300ul）至新管； 0 20ul 40ul 60ul 80ul 100 ddH2O 100ul 80ul 60ul 40ul 20ul 0 0.5mg/ml BSA 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 考马斯亮蓝溶液 6 5 4 3 2 1 蛋白定量标准曲线 原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质分子结合形成复合物，在595nm处有最大光吸收，其值在一定范围内（0-50ug）与蛋白浓度成正比。优点：简单易行；缺点：各种干扰因素较大 方法：2ul样品+98ul ddH2O SDS（SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳） 蛋白质电泳的行为：带电性和分子量 浓缩胶（4%）PH 6.8 分离胶（5-15%） PH 8.8 57-212 5.0 36-94 7.5 16-68 10 12-43 15 线性分离范围（KD) 分离胶浓度（％） PH 8.3 分离胶：1.5M Tris-HCl pH8.8；50μl 10% APS,10μl TEMED 浓缩胶：0.5M This-HCL pH6.8；50μl 10% APS,20μl TEMED 10 50 0.1 2.5 3.3 4.1 10%（分离胶） 20 50 0.1 2.5 1.3 6.1 4%(浓缩胶) TEMED 10% APS 10% V/V SDS Gel buffer （30% acr/bis） 凝胶储备液 ddH2O（ml） 胶浓度 湿法：将凝胶和固相基质象夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜，需冰盒散热。步骤较为繁琐。蛋白质分子量较大（100KD）建议用湿转。 转 膜 半干法：将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液浸润的滤纸之间。与湿转相比，半干法又快（15-45分钟）又方便。可以同时高效转移大小不同的蛋白。小分子量的蛋白半干转效果比较好。 转膜步骤 1、将电泳后的胶取出浸入Transfer Buffer，摇床缓慢摇30分钟。戴手套裁取PVDF膜，甲醇浸透，