分子生物学-9.pptVIP

基因敲除 (gene knock out) 或基因靶向灭活 (gene target inactivation) 体外构建的突变靶基因通过同源重组机制置换基因组中的正常靶基因，以研究靶基因的功能。 原核生物的基因敲除 动物的基因敲除 利用小鼠和大鼠基因敲除模型研究疾病相关基因、 测试药物等。 基因敲除方法 1. 同源重组方法 (传统) 当外源 DNA 片段与宿主基因组片段同源性高时，同源 DNA 区部分可与宿主 DNA 的相应片段发生交换 (即同源重组)。 2. 核酸酶介导的基因敲除 ZFN (Zinc-finger nucleases, 锌指核酸酶) TALEN (transcription activator-like effector nucleases, 转录激活因子样效应因子核酸酶) CRISPR/Cas9 CRISPR (clustered regulatory interspaced short palindromic repeat, 短回文重复序列) Cas (CRISPR-associated): DNA 核酸内切酶 GCATGCATGCATGCA CGTACGTACGTACGT GGCCAATTGGCCAATT CCGGTTAACCGGTTAA 载体中的 突变靶基因 负选择性标记 (tk) GCATGCATGCATGCA CGTACGTACGTACGT GGCCAATTGGCCAATT CCGGTTAACCGGTTAA 基因组中的正常靶基因 1. 确定靶基因 2. 构建载体 克隆靶基因及其上、下游的 DNA 序列到载体中，并使 靶基因发生突变。 同源重组方法 GCATGCATGCATGCA CGTACGTACGTACGT GGCCAATTGGCCAATT CCGGTTAACCGGTTAA 基因组中的正常靶基因 X X GCATGCATGCATGCA CGTACGTACGTACGT GGCCAATTGGCCAATT CCGGTTAACCGGTTAA 负选择性标记 (tk) 载体中的 突变靶基因 GCATGCATGCATGCA CGTACGTACGTACGT GGCCAATTGGCCAATT CCGGTTAACCGGTTAA 基因组中的正常靶基因 X X GCATGCATGCATGCA CGTACGTACGTACGT GGCCAATTGGCCAATT CCGGTTAACCGGTTAA 负选择性标记 (tk) 载体中的 突变靶基因 3a. 载体中的突变靶基因与基因组中的正常靶基因发生同 源重组 4a. 突变靶基因置换基因组中的正常靶基因 GGAATTCCAATTCCGGAATTCCATTGCCATATTCGTCCGGAAT CCTTAAGGTTAAGGCCTTAAGGTAACGGTATAAGCAGGCCTTA X X GCATGCATGCATGCA CGTACGTACGTACGT GGCCAATTGGCCAATT CCGGTTAACCGGTTAA 载体中的 突变靶基因 负选择性标记 (tk) GGAATTCCAATTCCGGAATTCCATTGCCATATTCGTCCGGAAT CCTTAAGGTTAAGGCCTTAAGGTAACGGTATAAGCAGGCCTTA GCATGCATGCATGCA CGTACGTACGTACGT GGCCAATTGGCCAATT CCGGTTAACCGGTTAA 载体中的 突变靶基因 负选择性标记 (tk) 3b. 载体中的突变靶基因与基因组 DNA 发生非同源重组 4b. 基因组携带 DNA 正常靶基因和突变靶基因以及负选 择性标记 (thymidine kinase, tk) / /cn/ 转基因 (Transgene) 构建表达载体 转染细胞 转基因动物 稳定细胞株 显微注射目的基因到受精卵中 将目的基因转染到胚胎干细胞 / 基因敲入 (knockin) 基因敲入是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠或大鼠的相应基因位点，使用小鼠或大鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 GFP / * 基因治疗 一、基因治疗及其策略 基因治疗 (gene therapy) 是指把基因或 RNA 导入人体细胞，使其发挥生物学效应，从而达到治疗疾病的技术方法。 基因置换 (gene replacement) 基因增补 (gene augmentation) 基因干预 (gene interference) 自杀基因 (suicide gene) 治疗恶性肿瘤 　 1. 基因置换 通过同源重组，用正常基因取代细胞内的致病基因。 　 2. 基因增补