丙型肝炎实验室诊断技术研究进展材料.ppt

丙型肝炎实验室诊断技术研究进展 丙型肝炎呈全球性流行，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。全球HCV的感染率约为3％，每年新发HCV病例约315万例，我国人群抗-HCV阳性率为3.2％，近4千万感染者。以长江为界，北方(3.6％)高于南方(2.9％)。目前尚无有效疫苗用以预防丙型肝炎。母婴传播率不超过6％。 HCV是单链RNA病毒，包含约9600个碱基。HCV包含至少6种主要的基因型和大量的基因亚型。每种基因型的氨基酸顺序差异约为30％。按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写的英文字母表示基因亚型(如1a、2b等)。基因型的分布存在地区差异。基因1型呈全球性分布，占所有HCV感染的70％以上。在我国大陆地区，以1b、2a型为主，输血途径感染者多为1b型，在欧洲和日本以1b型为主，中东地区以4型常见，6型主要见于香港和澳门地区。基因型的意义在于其与抗病毒治疗效果的相关性十分密切。 1.抗HCV抗体检测 1.1 ELISA 目前临床诊断和采供血机构多采用第三代ELISA试剂，其在第二代试剂的基础上增加了非结构区NS3区C33C抗原的比例，且采用基因重组技术、抗原纯度和活性提高，灵敏性、特异性均有较大提高。 1.2胶体金法(PA) 原理：将胶体金结合HCV重组抗原固相于玻璃纤维上，待测样本中抗-HCV与之反应形成复合物，后者向上移动被固定于硝酸纤维素膜上的HCV抗原捕获，形成一条阳性色带，15 min即可判断结果。 优点：该方法操作简单、无需特殊实验条件及仪器设备，灵敏度及特异性均较高，对丙型肝炎的早期发现及预防控制有重要参考价值。 1.3 化学发光技术(CLIA) 是化学发光测定技术与特异性免疫反应相结合的一种检测方法，可行抗-HCV定性、定量检测，灵敏度、准确性较高，且可避免放射污染，临床应用趋于广泛。 1.4重组免疫印迹实验(RIBA) 利用基因重组技术和包被技术将HCV不同重组抗原片段包被于醋酸纤维薄膜条带的不同位置，待测样本中抗-HCV与之结合后产生色带。第一代RIBA试剂含有C100-3、 5-1.1两种抗原(包括SOD序列)，与ELISA相比特异性明显提高，但灵敏度降低；第二代RIBA试剂在第一代基础上增加了3个重组多肽，灵敏度和特异性均有较大提高，是抗-HCV确证的金标准；第三代mBA在第二代基础上增加了NS5区抗原，可用于对第二代RIBA结果不确定标本的确证。 2 HCV核酸检测 2.1 HCV-RNA定性、定量检测 ①PCR：是一种模拟体内天然DNA复制过程的体外核酸扩增技术。RT-PCR是将RNA反转录和cDNA聚合酶链式扩增相结合的技术。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。检测低限为50～100 IU/ml。临床PCR单项阳性结果即可确诊HCV感染。 ②支链DNA(bDNA)技术：是一种不依赖PCR的核酸 放大定量方法。bDNA分支可结合RNA与包被于固相板上的探针杂交，固定后加入多个靶探针分别与HCV RNA 5’非编码区和核心抗原区的不同位点杂交使信号放大数十倍，加入bDNA扩增后可与各靶探针结合，使每个核酸信号得以放大数百倍，通过底物发光检测。bDNA技术的优点是放大倍数确定、重复性好，可用于HCVRNA的动态变化研究，但其检测限高于RT-PCR方法。 ③转录介导的扩增术(TMA)： 特点是利用MMLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶2种酶的共同作用。优点为整个反应在一个试管中进行，显著减少了污染的可能。与RT-PCR比较定性检测低限更低。 2．2 HCV RNA基因型检测HCV可分为6种主要基因型 及11个主要亚型。 ①限制性片段长度多态性方法(RFLP)： 是较早出现的分型方法，其利用RT-PCR扩增具有 不同酶切位点的各种HCV基因型，PCR产物被3～5种不同的限制性内切酶消化后，将电泳结果与已知限制性片段数据库比较确定其基因型。PCR-RFLP扩增的区域可以是5’UTR、核心区及NSSB。但RFLP由于其检测准确性低、成本高等原因，临床应用较少。 ②反相线性探针杂交法(Li-PA)： 基于反相杂交原理，通过生物素标记的引物扩增HCV5’UTR，产物变性后与硝酸纤维膜上基因型特异探针杂交，加入碱性磷酸酯酶和显色底物BT/BCIP后可显现紫色或棕色条带。该技术检测成本低，与金标准一致性很高，应用前景较好。 ③测序法： 原理是扩增HCV基因组种系信息区(NS5B、核心区或E1)并测序，将结果与已知基因型序列比较从而判断基因型，是HCV基因型检测的金标准。该法成本较高，临床应用较少，但在流行病学研究和亚型检测中能提供更全面的信息。 ④基因芯片技术： 基本原理是将大量探