SrDNA基因的PCR扩增说课.ppt

16S rDNA基因的PCR扩增 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 我们实验的反应体系 10×Taq聚合酶反应缓冲液2.5μL dNTP(20mmol/L)2μL 5’端引物（25pmol/μL）1μL 3’端引物（25pmol/μL）1μL 菌体DNA（约50ng/μL）1μL Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5μL H2O 补足总体积25μL 反应条件为：首轮循环94℃变性2min；再接94℃30s，50℃30s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸20min。 取5ul反应液,1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果 * * PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ 解旋酶 解链酶 DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 GGAUCG 5‘ AUCGCG 5‘ 引物酶 引物酶 RNA引物 RNA引物 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 GGAUCG 5‘ AUCGCG 5‘ TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3’ ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG 3’ DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…… PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 Kary B. Mullis The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 生物样品 DNA片段 基因诊断 基因治疗 基因工程产品 法医学检测 人类学研究 …… 基因组DNA 获取特定DNA片段 扩增特定DNA片段 94℃变性 50-65℃退火 XX℃延伸 94℃ 55℃ 37℃ Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 酶活性(%) 温度(℃) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 标准的PCR反应体系 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 　　　　 　 各10～100pmol 模板DNA 　　　 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 　　　　　 1.5mmol/L 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单