SSR分子标记说课.ppt

B.银染法操作： 固定30min→去离子水洗涤30s，2次→染色30min→去离子水洗涤2次(每次不超过30S)?→显色至所需要的程度→去离子水洗30s终止显影。 第五步：结果分析 SSR分子标记引物设计 相关文献 近缘种的引物 数据库搜寻法 构建基因组文库，筛选SSR标记 构建基因组文库，筛选SSR标记 4.SSR标记的应用 SSR标记因为具有共显性、高度重复性、高度丰富的多态性等优点，成为构建遗传连锁图谱、研究群体遗传学、进行分子标记辅助育种、系谱分析、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测、目标性状分子标记筛选和法医鉴定的理想工具。目前在植物基因组中SSR标记研究非常活跃。SSR标记技术已经应用于拟南芥、大豆、棉花、花生、葡萄、小麦、水稻、番茄、甜菜和油菜等多种植物上。 SSR分子标记 王丹 目录 1.SSR标记技术的概念和原理 3.SSR标记的操作步骤 2.SSR标记技术的特点 4.SSR标记的应用 1.SSR标记技术的概念和原理 简单重复序列（Simple Sequence Repeat ，SSR），指的是基因组中由1-6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在100bp以内。 SSR的产生是在DNA复制或修复过程中DNA滑动和错配或者有丝分裂、减数分裂过程姐妹染色单体之间发生不均等的交换的结果。 不同遗传材料重复次数的可变性，导致SSR长度的高度变异性，这一变异性是SSR标记产生的基础。微卫星的突变率很高，从而产生了很多等位基因，导致了微卫星的高度多态性。一般认为微卫星丰富的多态性是微卫星不稳定性的表现。 微卫星主要以两个核苷酸为重复单位，也有一些微卫星重复单元为3个核苷酸，少数为4个核苷酸或更多。SSR的基序中最常见的是（CA）n和（TG）n，在植物基因组中（AT）n最多。 SSR标记的多态性 由于微卫星寡核苷酸的重复次数在同一物种的不同基因型间差异很大，微卫星呈共线性遗传。 SSR标记原理 尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计以对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可以获得其长度多态性，即SSR标记。SSR标记的高度多态性主要来源与串联数目的不同。根据分离片段的大小决定基因型，并计算等位基因发生频率。 SSR标记多态性分析 2.SSR标记技术的特点 SSR标记技术一般检测到的是一个单一的多位点等位基因位点。 微卫星呈共显性遗传，符合孟德尔遗传规律。 SSR标记所需的DNA较少，仅需微量组织。 SSR标记位点转化性。 SSR标记数量丰富。标记覆盖整个基因组，而且分布均匀。 实验重复性好，结果可靠性高。 SSR序列的两侧序列常较保守，在同种而不同遗传型间相同。 多数SSR无功能作用，增加或减少几个重复序列频率高，因而在品种间具有广泛的位点变异。 利用SSR标记技术进行研究时，由于创建新的标记时需要知道重复序列信息，如不能直接从DNA数据库存查询，则首先必须对其进行测序。因此其开发有一定的难度，费用也较高。必须根据微卫星侧翼序列设计引物，减少了其应用范围。虽然开始筛选重复序列和引物设计过程较慢，但只要引物确定，使用便极为方便，结果极为可靠。 SSR标记的难点 3.SSR标记的操作步骤 第一步：DNA 提取： 提取DNA并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。 第二步：PCR : PCR体系： 模板DNA 引物 氯化镁 4种dNTP混合物 PCR缓冲液 TaqDNA 聚合酶 PCR反应程序 ： 变性94 ℃ → 复性（或退火）50-62℃ → 延伸72 ℃，一般30-35个循环 第三步： 琼脂糖电泳检测扩增质量（1%-2%琼脂糖凝胶）；扩增产物电泳分离：一般用8%变性聚丙烯凝胶电泳检测扩增产物 第四步：染色（多采用银染法）： A.银染液的配制： 固定液(100mL冰乙酸加水稀释至1000mL)； 染色液(1.3gAgNO3、1．5mL37％甲醛，加水稀释至1000mL)； 显色液(30gNa2CO3、1．5mL37％甲醛0．2mL 20mg/mlNa2S203，加水稀释至1000mL)； 终止液(10％冰乙酸)。 微卫星分子标记对18份山羊草基因型的扩增结果