第5章 目的基因制取.pptVIP

* 羟基磷灰石柱可吸附双链DNA、单链DNA，洗脱条件不同，0.27M磷酸缓冲液可洗脱双链，用0.12M磷酸缓冲液主要洗脱单链。 双链DNA和过量RNA被除去，单链DNA吸附在柱子上 * * Mung Bean Nuclease 绿豆核酸酶 * SSH法的PCR产物可直接标记成探针，混合探针可以用于全长CDNA文库的杂交，筛选差异表达基因的全长CDNA。 设计了一个用于逆转录的基因特异引物GSP-RT，进行逆转录，合成（-）cDNA。 用RNase降解RNA，然后用末端转移酶在（-）cDNA的3‘端加poly(A或C)尾 再用锚定引物合成第二链(+)cDNA, 接下来与3’ RACE过程相同。用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物GSP进行PCR扩增。 5’RACE ★ CIAP(牛小肠磷酸酶)除去5’磷酸，非全长mRNA的5‘端无法进行连接，而全长分子有5’-cap的保护 TAP（烟草酸焦磷酸酶）去除5’-cap，加入锚定引物，在RNA连接酶作用下将其连在全长mRNA 5‘端 嵌套PCR进行5’ RACE 连接酶介导的RACE ★ 通常的克隆方法是同时使用一个切点位于接头序列上的限制性内切酶和一个切点位于扩增区域内的内切酶。由于大多数非特异性扩增的cDNA产物不能被后一个限制性内切酶酶切，因而也就不会被克隆．从而增加了克隆的选择效率。 也可在基因特异性引物的 5’端掺人一个限制性内切酶的酶切位点的方法来克隆。最后，从两个有相互重叠序列的3’和5’RACE产物中获得全长cDNA。 最后通过分析RACE产物的3’和5’端序列，合成相应引物来扩增mRNA的反转录产物，从而获得全长cDNA。 优点： 无需提纯mRNA,可直接从总RNA中得到目的基因全长序列,无需做克隆文库，只需做5‘端目的产物和3’端目的产物的亚克隆 缺点： 5’端的编码区经常会由于反转录过程的不彻底而丢掉,特别是由于有大的转录物或者存在复杂的二级结构时 连接反应通常效率很低, 不能保证PCR的高成功率 经常出现非特异性扩增产物 ★ （2）载体引物法 RNA经CIAP,TAP,RNA连接酶处理连上5‘端锚定引物后，加入具有多聚T尾巴的载体引物（即整个载体作为衔接体） 反转录后用5’端锚定引物合成第二链，直接酶切处理进行自连接，转化宿主细胞得到全长cDNA文库。 P183 图 （3）固相支持物法 高碘酸钠处理5’cap后，可以在5’cap接上生物素，因此全长mRNA全部有生物素标记 逆转录后用RNaseI水解单链核酸（RNA-DNA杂交双链不被水解） 用亲和素包裹的磁性珠作为固相支持物，结合杂交链 ，得到全长cDNA第一链 184 图8.18 ☆ ☆ (4).SMART技术 SMART (Switching Mechanism At 5‘ end of the RNA Transcript)，模板转换机制 原理： 逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5‘ 帽子时会在cDNA3‘末端加上几个C，在逆转录时加入3’末端带Oligo（dG）的SMART引物，它与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于只有5帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。 ★ ★ cap cap Poly C Poly G 利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，只要单管，一步即可完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA（RACE），和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。 3.4 差示文库和消减文库 （1）mRNA差别显示 mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简称为ddRT-PCR。它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。 差别基因表达（differential gene express）是细胞分化的基础。mRNA差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快