第6章 蛋白质的分离、纯化和表征.pptVIP

蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大 pI通常在 6.0 左右 蛋白质电泳： 在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带 正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于 等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电 场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳— 带电粒子在电场中移动的现象。 蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象 利用蛋白质的电泳现象，可以将不同带电性质和不同大小、形状的蛋白质分子进行分离纯化。 根据蛋白质净电荷的差异来分离蛋白质的一种方法是电泳法。 蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12 ≈1.66×10-27千克 （一）根据化学组成测定最小分子量 （二）SDS－PAGE测定相对分子质量 （三）凝胶过滤法测定相对分子质量 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 2、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时，相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层。使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致互相凝聚而沉淀。 蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相对稳定的。 蛋白质沉淀定义： 蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。 吃柿子小心胃结石！ 年龄偏大的人，消化功能减退，多食易得柿石病。空腹也不要多吃柿子。 如果连皮一起吃更容易形成胃结石，皮中含的鞣酸更多。 含高蛋白的蟹、鱼、 虾在鞣酸的作用下， 很易凝固成块，形 成胃结石。 五、蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 （二）利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 2.盐溶和盐析 （三)根据电荷不同的分离方法—电泳 原理： 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 分子大小不同，电场中移动速度也不同 （四）利用蛋白质选择性吸附的性质 羟磷石灰层析 疏水作用层析 （五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法 六、蛋白质含量测定和纯度鉴定（略） 5.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI） 生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。（小檗碱、麻黄碱 、吗啡） 能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。 生物碱试剂沉淀蛋白质的机理： 在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。 例如：“柿石症” 6.加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐促进蛋白质加热凝固。 当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速. 如：煮鸡蛋 卤水点豆腐 （少量MgCl2加入到大豆 蛋白质的浓热溶液中） 四、蛋白质分离纯化的一般原则 总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶 利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开 半透膜为玻璃纸或纤维素材料 血液透析 小分子溶出 小分子被带出 透析机 透析液 加压 血液 2、密度梯度（区带）离心 60000~80000转/分 重力60万～80万倍 3、凝胶过滤 3.有机溶剂分级分离法 降低介电常数 争夺水化膜 等电聚焦电泳 双向电泳 离子交换层析 亲和色谱颗粒 具有极强的专一性 第6章 蛋白质的分离纯化和表征 一、蛋白质的两性电离及等电点 蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 电泳 二、蛋白质分子的大小 1、测定蛋白质中某一微量元素的含量 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子 最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量 蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于： 所带电荷 分子量 分子形状 十二烷基磺酸钠 原态蛋白质 变性 ？ 磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区） 迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量 巯基乙醇破坏二硫键 蛋白质混合样 凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量 （一）胶体性质（colloidal syste