流式细胞检测讲座要点.ppt

FACSAria光学滤片 检测器排列 （激光器） 光电倍增管 BP滤光片 可用染料 八角形 （488nm蓝色激光） A 780/60 PE-Cy7 B 695/40 PerCP-Cy5.5, PerCP C 610/20 PE-Texas Red D 575/26 PE E 530/30 FITC 三角形 （633nm红色激光） A 780/60 APC-Cy7 B 660/20 APC 三角形 （407nm紫色激光） A 530/30 Alexa Fluor 430 B 450/40 Cascade Blue, Pacific Blue, DAPI, Hoechst, Alexa Fluor 405 荧光染色对照 阳性对照 使用已知阳性样本，帮助排除试剂的质量、浓度、特异性以及染色方法等因素 阴性对照 空白对照（自发荧光） 自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高，自发荧光越强。 实验样本（自发荧光＋特异荧光＋非特异荧光） 特异荧光，即抗体F(ab’)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光 非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光 同型对照（自发荧光＋非特异荧光） 同型对照 同型对照（Isotype Control） ： 与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 与染色的单克隆抗体 ①相同种属来源 ②相同免疫球蛋白及亚型 ③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 ⑤但由未免疫动物血清纯化而来 用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色 例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1（γ1）和IgG2a（ γ2a），并分别标记FITC和PE 荧光染色补偿对照的设置 补偿对照（双色或多色分析时） 荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号 将单种荧光素标记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色 ※几色分析就需要制备几个补偿对照管 设置补偿的基本步骤： ①上同型对照管，调节PMT电压，使阴性细胞群体处于双荧光散点图的左下角101道以内； ②分别上单阳补偿管，依次调节相邻荧光的补偿设置，直至阳性和阴性细胞群处于最合适的位置 双色荧 光补偿 双色荧 光补偿 双色荧 光补偿 双色荧光补偿 实验设计实例 分析类型 管 功能 加入的抗体 单色分析 1 Isotype γ1-FITC 2 Sample1,2…… A-FITC 双色分析 1 Isotype γ1-FITC γ2a-PE 2 Compensation1 A-FITC γ2a-PE 3 Compensation2 γ1-FITC B-PE 4 Sample1,2…… A-FITC B-PE 三色分析 1 Isotype γ1-FITC γ2a-PE γ1- PerCP 2 Compensation1 A-FITC γ2a-PE γ1- PerCP 3 Compensation2 γ1-FITC B-PE γ1- PerCP 4 Compensation3 γ1-FITC γ2a-PE C-PerCP 5 Sample1,2…… A-FITC B-PE C-PerCP 四色分析 1 Isotype γ1-FITC γ2a-PE γ1- PerCP γ1- APC 2 Compensation1 A-FITC γ2a-PE γ1- PerCP γ1- APC 3 Compensation2 γ1-FITC B-PE γ1- PerCP γ1- APC 4 Compensation3 γ1-FITC γ2a-PE C- PerCP γ1- APC 5 Compensation4 γ1-FITC γ2a-PE γ1- PerCP D- APC 6 Sample1,2…… A-FITC B-PE C-PerCP D- APC No. Antibody Isotype Mouse anti-human 未免疫Mouse 血清纯化而来 1 A-FITC（γ1） γ1-FITC 2 B-PE（γ2a） γ2a-PE 3 C-PerCP（γ1） γ1- PerCP 4 D-APC（γ1） γ1