蛋白质的分离纯化1说课.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 常用的离子交换剂类型 Type of ion exchangers weak strong strong weak 交换反应 阳离子交换树脂 阴离子交换树脂 R-SO3H + M+ R-SO3M + H+ RN+(CH3)3OH- + X- RN+(CH3)3X- + OH- R-NH2 + H2O R-N+H3 OH- 水合作用 RN+H3OH- + X- RN+H3X- + OH- 梯度洗脱的实验装置 ?KTA purifier 离子交换柱的操作 Step 1, 装柱 量化 估计需要结合的样品量 用 ~5X的量去装柱 查看技术参数单 浸洗,调节pH值. Step 2, 平衡 Initial buffer: 其pH值和离子强度等能使样品中有效成分与离子交换剂结合 anion exchangers ---pH比有效成分的pI高一个单位 cation exchangers pH比有效成分的pI低一个单位 低离子强度 Step3, 加样及平衡 The interaction is a dynamic equilibrium that can be influenced by pH or salt concentration Adsorption The larger the net charge， the stronger is the adsorption. Step 4,梯度洗脱 Elution buffer:其pH值和离子强度等能使样品中有效成分从离子交换剂上解离下来. Step 5,高盐冲洗 各个蛋白质成份在离子交换柱上的分离——解吸附条件的差别Desorption Essentially two possibilities exist to desorb sample molecules from the ion exchanger: Reducing the net charge by changing pH. Adding a competing ion to block the charges on the ion exchanger. The higher the net charge, the higher the salt concentration required for desorption. 离子交换色谱的主要洗脱模式 梯度洗脱 阶段洗脱 梯度的陡度对分离度的影响 离子交换色谱在操作上的注意之处 注意各种厂家提供柱材料的pH范围；注意流速范围（压力范围），以免损坏胶颗粒。 注意装柱（均匀，无气泡），保养（高盐再生）及贮存（加防腐剂）。 准备蛋白样品使其处于与平衡缓冲液相同的pH及离子强度的环境之中，注意蛋白的溶解性，不要有沉淀产生及颗粒物质；样品中应该避免含有去污剂。 蛋白总量不应超过柱的结合容量（进样量一般为介质交换容量的10-20%），上样体积一般无特殊的限制。 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高。 * * * * * * * * * * * * * * * 离心机(尤其是可控低温高速离心机)价格昂贵,且运行时有一定的危险性,请小心使用! 固定角度离心机(Fixed-Angle Centrifugation) 水平离心机(Swinging-Arm Centrifugation) 差速离心(Differential Centrifugation) For example: 超滤(Ultrafiltration) 离心超滤 压滤 3.2 蛋白质(粗)分离:(II)表达蛋白 用生物信息学方法选定目标蛋白 及相应的DNA文库或cDNA文库 回收PCR产物并将基因克隆至表达载体 将表达载体转化至表达菌株 设计,合成PCR引物并从相应文库中进行PCR 诱导表达目的蛋白 提取表达载体进行酶切鉴定是否含目的基因 Y N Harvest Cells Cell Disruption Total Proteins Pure Protein Analytical Tests 培养介质 细胞碎片 非目的蛋白 Centrifugation Filtration Enzymatic Chemical Phy