单核苷酸突变说课.ppt

Simple generation of albino C57BL/6J mice with G291T mutation in the tyrosinase gene by the CRISPR/Cas9 system利用CRISPR/Cas9法制备白化病小鼠动物模型 文章截图 CRISPR/Cas9基因编辑系统 CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌免疫防御系统，该系统通过将DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列在Cas9 核酸酶作用下降解，从而提供免疫性。 ①能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以在同一只小鼠中，同时使不同基因产生多个基因突变。 ②将Cas9/sgRNA 与带突变的序列共注射，能准确在小鼠基因引入所要的位点突变。 CRISPR/Cas9基因编辑系统 摘要 SNMs(单核苷酸突变)与多种人类疾病相关。预期CRISPR/Cas9基因编辑系统将是诱导小鼠单核苷酸突变的理想方法。本设计探究用CRISPR/Cas9载体和单链DNA共转入受精卵的雄原核制备白化病小鼠的可行性。 首先为酪氨酸酶基因构建一个CRISPR/Cas9表达载体px330-Tyr-M。该载体的活性通过EGxxFP系统进行验证。我们还设计了一个ssDNA(单链DNA)序列对目标基因进行同源重组定向修饰。 px330-Tyr-M 载体活性验证 px330-Tyr-M载体与变异的ssdna供体共转入小鼠受精卵 px330-Tyr-M载体与变异的ssdna供体共转入小鼠受精卵 白化病小鼠基因测序 脱靶验证 测序了与目的基因相似的几个基因（3端的16个基因NGG）没有发生脱靶。 传代稳定性验证 克莱德飞 基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。 CRISPR/Cas9该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。通过一系列研究，该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。 背景 CRISPR/Cas9质粒与ssDNA供体共同转染C57BL/6J小鼠受精卵的雄原核。共操作了224个单细胞时期的受精卵，得到60只小鼠，其中眼、皮肤白化病(除眼色素缺乏和视力低下、畏光等症状外，小鼠皮肤和毛均有明显色素缺乏）的小鼠28只，测序分析发现其中11只小鼠在络氨酸酶基因(G291T)上发生了单核苷酸突变，其中有一只为纯合子突变。没有发生络氨酸酶基因(G291T)单核苷酸突变的小鼠，在其靶位点附近也发生了基因缺失和插入的突变。 利用CRISPR/Cas9载体和ssDNA供体共同转染受精卵的雄原核制备研究人类疾病的动物模型是可行的。 摘要 · CRISPR/Cas9表达载体的构建：px330-Tyr-M · px330-Tyr-M 载体活性验证 · px330-Tyr-M载体与变异的ssDNA供体共转入小鼠受精卵 · 白化病小鼠基因测序 · 脱靶验证 · 传代稳定性验证 实验步骤 px330质粒被用来表达靶位点的gRNA（向导RNA）和Cas9 核酸蛋白。 我们将络氨酸酶基因的279–298 bp的序列插入px330质粒，最后得到 px330-Tyr-M载体。 CRISPR/Cas9系统可识别并切开G-N(20)-GG序列，我们挑选络氨酸酶基因的279–301位点。 CRISPR/Cas9表达载体的构建