2011组织培养实验(植物部分).docVIP

组织细胞培养技术实验教案 实验一 植物组织培养的培养基的配制、灭菌与仪器操作培训 实验二 植物的离体培养 实验三 植物离体培养中的形态观察和愈伤组织继代培养 实验四 动物细胞培养的培养基配制灭菌与仪器操作培训 实验五 鸡胚原代细胞的培养 实验六 动物细胞的传代培养 实验七 动物细胞的冻存与复苏实验一 植物组织培养的培养基的配制、灭菌与仪器操作培训 【目的要求】 学习并掌握植物组织常用培养基的组成、配制与灭菌方法。培养基能够提供植物生长、繁殖所必须的各类营养物质，以及生长因子，是开展植物组织培养研究的基础和前提。植物的种类不同，研究的目的不同，所需要的培养基的种类也各不相同。 实验用具：电子天平、烧杯、量筒三角瓶或培养瓶、移液管、药匙、玻棒、pH试纸、吸耳球、牛皮纸、皮筋等。 药品：蔗糖、琼脂、0.1mol/L NaOH、 0.1mol/L HC、各种培养基母液、激素母液 分组配制培养基用分析天平称取生长素或细胞分裂素50-100mg。生长素用少量95%的酒精或0.1mol/L的NaOH溶解，细胞分裂素用0.1mol/LHCL加热溶解。加蒸馏水定容至100ml配制成0.5-1mg/L的溶液。∨激素﹦∨配制×培养基中所要求的激素浓度 ÷ 激素母液浓度湿热灭菌培养基称取规定数量的琼脂，加水到培养基最终容积的3/4，水浴或电炉使之加热溶解。根据配方要求，把按顺序量取的各种母液以及称取的蔗糖，都加入煮好的琼脂中，然后加水定容。 用0.1mol/L的NaOH或者HCl调pH。分装培养基，包好或盖好，标明编号。121℃(103kPa)灭菌15-20min。 作好植物组织培养的各项准备工作制备无菌水：121℃ (103kPa) 灭菌40min配制0.1% HgCl2溶液（放置棕色瓶中）准备接种用培养皿、金属器械等用具。 —次，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒。 实验中所用的各种容器一定要洗净、烘干。用电子天平称量药品时，一定要用称量纸，对于有腐蚀性的药品，应将其放置在小烧杯中称量。各种母液应保存在2-4℃的冰箱中，以免变质、长霉。使用高压灭菌锅时，一定要正确操作，并提前检查其中的水是否合适。HgCl2属于一种腐蚀性极强的剧毒物品，配制时要注意安全。 实验二 植物的离体培养（两次课程） 【目的要求】 1：尝试进行植物的组织培养 2：了解植物组织培养的基本原理 ??? 材料：，灭菌培养基，体积分数为70%的酒精，体积分数为20%的次氯酸钠溶液，无菌水??? 用具：锥形瓶或大试管，烧杯，酒精灯，恒温箱，接种箱，滤纸，消毒用酒精棉球，培养皿，解剖刀，镊子外植体消毒：在接种箱上将胡萝卜段用酒精消毒并用无菌水清洗，再用次氯酸钠处理，立即用无菌水消毒。用无菌滤纸吸去表面的水分，用无菌解剖刀锲成横切片，再选取有的部位，切成小块接种：将组织块接种到培养基上，用锡箔纸封盖瓶口，并用橡皮筋扎紧培养：将接种后的组织块，放在2326℃恒温避光条件下培养，后，检查培养材料的污染情况；14天后，观察愈伤组织的生长状况。实验三 植物离体培养中的形态观察和愈伤组织继代培养 【目的要求】 诱导愈伤组织是细胞培养的基础，愈伤组织经过不断继代培养才能变得疏松，易于分散，有利于建立良好的悬浮系。 【实验用品】 ??? 材料：??? 用具：锥形瓶或大试管，烧杯，酒精灯，恒温箱，接种箱，滤纸，消毒用酒精棉球，培养皿，解剖刀，镊子 选择待培养物伤口周围长出的淡黄色、疏松、生长良好的愈伤组织转移至新培养基中继代。 培养：将接种后的组织块，放在2326℃恒温避光条件下培养，后，观察愈伤组织的生长状况。 ml、链霉素100U/ml。（传统市售青霉素80万U/瓶，可溶于4ml体积；市售链霉素为100万U/瓶，可溶于5ml体积；用时每L培养液各加0.5ml。另：青霉素钠链霉素碱 1000／mg链霉素798／mgg/L NaCl 8.00 g/L CaCl2 0.14 g/L ① 先单独溶解CaCl2于100ml超纯水（或三蒸水）； ② 再单独溶解MgSO4 7H20于100ml超纯水； ③ 再单独溶解其他成分于650ml超纯水(按表中顺序,每次待前一成分充分溶解再加下一种成分)； ④ 将①液和②液缓慢倒入③液中，并不时搅动，防止沉淀。 ⑤ 将0.35g NaHCO3溶解于37℃ 100ml超纯水 ⑥ 用数滴NaHCO3液溶解0.02g酚红 ⑦ 将⑤、⑥液逐滴并搅拌加入④液 ⑧ 将⑦液移入容量瓶，定容至1L，混匀。 ⑨ 高压灭菌（8磅10min），4℃保存。 四、总结与讨论 1、写出自己所在的小组准备出的全部用品，并说明其处理方法。 2、写出实验室的CO2培养箱和倒置