分子生物学实验技术实验内容.doc

2006年《分子生物学实验技术》实验内容 一、RT-PCR （一）总RNA的提取 实验安排： 每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： 1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-BiotragentsTM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。 将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 在4℃条件下，以10000×g离心15min。 将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。 将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2、所用的塑料用0.1% DEPC水浸泡。配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。操作人员戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。每人做一管。20μl）：按下列顺序加样 5×Buffer 4μl dNTPs 6μl RNA酶抑制剂 μl Oligo（dT） μl 随机引物 1μl 反转录酶AMV 1μl 提取的RNA 6μl 总体积 20μl 反应条件：42℃ 1h 注意事项： 1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。 2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。 3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。 4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20℃，以防酶失活。 （三）PCR 实验安排： 每人做一管。 反应体系（50μl）：按下列顺序加样 ddH2O 32.7μl 10×PCR Buffer 5μl dNTPs 4μl P1 2μl P2 2μl Taq 0.3μl cDNA template 4μl Total 50μl 反应程序： 预变性 94℃ 2min 变性 94℃ 30s 退火 50℃ 45s 延伸 72℃ 1min 30 cycles 终延伸 72℃ 10min PCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳 电泳缓冲液TBE(10×)的配制： 称取Tris-base 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA(pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。 1.5%琼脂糖凝胶的配制： 称取1.5g琼脂糖于三角瓶中，加入10ml 10×TBE缓冲液，并加水定容至100ml，加热溶解后加入5μl EB(10mg/ml)，摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子即可用于电泳。 电泳检测： 取PCR产物5μl与Loading Buffer 1μl混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁加入5μl DL2000 DNA Marker作对照，以100V电压，50mA电流进行电泳，约15min后于紫外灯下观察结果。 注意事项： EB有致癌性，电泳操作需戴手套进行。 禁止将盛有EB的器皿随意乱放，且不要戴有EB污染的手套随意拿其它无EB的试剂或仪器。 （四）PCR产物的纯化 实验安排： 每两人的PCR产物合并后作为一管，用PCR产物回收试剂盒（E.Z.N.A. Gel Extraction Kit）回收目的DNA。 操作步骤： PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶中含目的条带的胶粒，放入预先称好重量的空1.5ml Ep管中。 将装有胶粒的Ep管放在电子天平上再次称重，计算胶粒的重量。 按1g胶加1ml的量加入Binding Buffer，置于55℃－65℃水浴中约7min，其间要摇动Ep管2－3次，使胶粒完全溶解。 将上述溶胶液加入到HiBind spin-column中，10000×g离心1min，弃去收集管中的液体。 加入300μl Binding