09第九章 其它标记免疫分析技术.pptVIP

第九章其它标记免疫分析技术 发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。 根据形成激发态分子的能量来源不同可分为: 光照发光、生物发光、化学发光等。 光照发光（photoluminescence）：发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。 生物发光（bioluminescence） ：是反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在恢复到基态时多余的能量以光子形式放出。典型例子为萤火虫发光。 化学发光（chemiluminescence）：在常温下由化学反应产生的光的发射。 化学发光是一个多步骤的过程，其机制为某些化合物（发光剂或发光底物）可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。 一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态。 反应过程可简单地描述如下： A十B C* C* C＋ h·γ 其中γ为光子，C*表示C处于单线激发态 若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光。 反应过程可表示如下： A十B C* C*十D C十D* D* D十h·γ 该反应必须提供足够的激发能, 并由某一步骤单独提供, 因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光; 要有有利的反应过程, 使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态; 激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放出光子, 或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子。 化学发光强度（ICL）取决于化学反应的速率（dc/dt）和反应的化学发光量子效率（ ΦCL ） ICL= ΦCLdc/dt ΦCL=ΦrΦf Φr:生成激发态产物的量子产率，也就是每一个参加反应的分子产生的激发态； Φf :激发态产物分子的发光量子产率，也就是每一个激发态产生的光子数，对于一定的化学发光反应，为一定值。 在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物称为化学发光剂或发光底物。 发光的量子产率高； 物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配； 能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物； 其化学发光常是氧化反应的结果； 在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。 在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。 在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物　N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。 三联吡啶钌 [RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光。 1．鲁米诺及其衍生物 2．AMPPD （luminol，5＇-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下 鲁米诺的衍生物主要有异鲁米诺、 4— 氨基已基 —N 一乙基异鲁诺及 AHEI 和 ABEI 等。鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化学发光反应，辐射出最大发射波长为 425nm 的化学发光。 〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕 只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。 在酸性条件下，可在实验室内临时制成一种重氮盐（重氮化反应），这种重氮盐在与一种芳香胺或苯酚化合时，生成偶氮化合物，称为偶联反应。 发光剂的选择； 被标记蛋白质的性质； 标记方法的选择； 原料比； 标记率； 温度； 纯化与保存。 类型： 第一种以发光剂作为抗体或抗原的标记物，直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量。 第二种是以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过