10 第十四章 分子定向进化育种.pptVIP

（2）DNA shuffling 1994年,Stemmer在Nature发表了一篇题为Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling的文章,首次提出了DNA改组(DNA shuffling)技术。Stemmer以β-内酰胺酶系统为试验对象,用DNA改组,经过三轮筛选和两次回交得到一新菌株,其头孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制浓度比原始菌株提高了32,000倍,也远高于易错PCR的突变筛选结果。 DNaseI产生随机片段； 2. 随机片段变性； 3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段 DNA改组是DNA分子的体外重组,是基因在分子水平上有性重组。通过改变单个基因(或基因家族)原有核苷酸序列,创造新基因,并赋予表达产物以新功能。实际上,该技术是一种分子水平上的定向进化。因此也称为分子育种。在创造新基因的过程中,要设法产生各种变异。这主要通过有性PCR、交错延伸PCR完成。 值得指出的是,DNA改组的效果必须由改组后的基因表达产物的功能来验证。因此,灵敏可靠的筛选方法是DNA改组技术成功与否的关键。 DNA改组是基因在分子水平上进行的有性重组，是一种反复性突变、重组的过程。主要包括以下步骤： a. 目的DNA片段的获得； b. 目的基因的随机片段化，即将目的基因（ 可以是单个基因或一组相关基因）酶切成随机片段，这些随机片段集合包含了来自不同的同源序列的寡核苷酸，这些寡核苷酸具有不同的3’末端，从而为下一步的无引物PCR提供了条件； c. 无引物PCR，即具有互补3’末端的寡核苷酸互为引物，各为模板，通过不断的PCR循环，在不同模板上随机互补结合并进一步延伸； d. 有引物PCR，即以上轮无引物PCR的产物为模板，加入基因两端序列为引物，经过多轮PCR得到重排产物的集合，称为突变文库； e. 克隆、筛选、分析及多轮筛选，即进一步对突变文库进行筛选，选择改良的突变体组成下一轮改组的模板，重复上述步骤进行多次重排和筛选，最终获得性状比较理想的突变体。 优点： ①DNA改组可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可以达到几十kb； ②通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高； ③DNA改组从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片断上序列的信息，简化了操作程序； ④DNA改组比随机突变显著提高了良性突变的概率。研究表明，DNA改组比随机突变具有较大的优势，随机突变的方法一般产生1%的良性突变，但DNA改组可产生13%的良性突变。 常规的筛选方法 表型观察选择和筛选:基于细胞生长率和生存率的筛选方法；或是基于蛋白质突变体库中酶的催化活性的筛选方法，主要依据强发色体底物(颜色变化)、易观察的克隆表现(溶解圈)或荧光产物来筛选突变体。 高通量筛选 三、突变文库的筛选 第十四章内容总结 1. 简述分子定向进化育种的原理？ 2. 理性定向进化育种利用哪些技术手段，各有何特点？ 3. 非理性定向进化育种利用哪些技术手段，各有何特点？ ？ 突变库经历了DNA 片段的重新组装, 与高错误倾向PCR 有本质的不同。该方法由多个亲本参与进化, 引入了重组、缺失、重复等多种突变类型, 并且可以迅速积累有益突变。 第十四章 分子定向进化育种 生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中,并维持其独立性和生命的延续性,都是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用.酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得以按照预定的方向有序,精确而顺利地进行,几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关,可以这样说,没有酶的存在,就没有生物体的一切生命活动.  天然酶（蛋白）的局限性 随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入,研究者发现,酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求,而且天然酶的稳定性差,活性低使催化效率很低,还缺乏有商业价值的催化功能。 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程. 定向进化是近20年发展起来的一项新技术，是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成的进化过程。 第一节 理性设计 寡核苷酸引物介导的定点突变 PCR介导的定点突变 盒式突变 定点突变技术是通过对目的蛋白的编码基因进行改造,短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它1