第8章 微生物菌种的筛选及鉴定.ppt

研究进展 文献综述 主 讲 惠 明 博士 本节要点 一、典型工业微生物菌种 细菌：枯草杆菌，短杆菌，大肠杆菌 酵母：酿酒酵母（啤酒，葡萄酒），酒精酵母，假丝酵母 霉菌：黑曲霉，土曲霉，米曲霉，红曲霉，根霉，木霉，青霉 放线菌：单孢菌 其他：藻类 常见工业微生物及其产物 细菌 短杆菌：谷氨酸、肌苷酸 枯草芽孢杆菌：淀粉酶、蛋白酶、核糖 大肠杆菌：酰胺酶 节杆菌：强的松 梭状杆菌：丙酮、丁醇 常见工业微生物及其产物 酵母 酒精酵母：乙醇 甘油酵母：甘油 假丝酵母：环烷酸、SCP 啤酒酵母：细胞色素、辅酶、酵母片 类酵母：脂肪酶 阿氏假囊酵母：核黄素 脆壁酵母：乳糖酶 常见工业微生物及其产物 霉菌 黑曲霉：柠檬酸、蛋白酶、单宁酶、 糖化酶 栖土曲霉：蛋白酶 根霉：糖化酶、甾体激素、 青霉：青霉素、葡萄糖氧化酶 木霉：纤维素酶 红曲霉：糖化霉、红曲色素 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造可操作性要强 遗传性能要相对稳定 不易感染杂菌或噬菌体 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关） 生产特性要符合工艺要求 2.2 从自然界中分离筛选菌种 生产菌株来源 1、索取或购买 2、自己选育 用原有菌株进行遗传改造进行育种 诱变育种/基因重组育种 向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选育 从自然界中分离菌种 从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。 从自然界中分离筛选菌种的一般步骤 设计方案→采样→增殖培养*→平板分离 →筛选（初筛、复筛）→单株纯种分离 →性能考察（生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定） 2. 采样方法 （1） 去除表层土 （2） 取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆料袋中 3. 注意 记录：时间，地点，环境情况等 样品袋应封好口，防止水分失去 土样应在分离前破碎 尽快分离 2.2.2增殖培养（富集培养） 适用：样品中目的菌数量不够多时 目的：提高样品中目的菌的数量和比例 原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制 1、 方法 （1） 控制营养成分 ?? ? ① 纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌 ②可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种 ③酒精废水，可以增殖废水利用菌 * 多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素 （2） 控制培养基pH 细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸 但非目的菌的生长不能被完全抑制 （3）控制培养温度 30℃左右培养，可培殖嗜温微生物 50~60℃培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株 （4）热处理——增殖芽孢细菌 样品悬浮液经80℃、10min处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌 （5）添加抑制剂 10%苯酚数滴：抑制细菌、霉菌生长，增殖放线菌 多粘菌素B：抑制G-细菌 青霉素：抑制G+细菌 制霉菌素：抑制真菌 放线菌酮：抑制真菌 2.2.3纯种分离 目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养 1 纯种分离的一般方法 稀释平板法 倾注平板或涂布平板 划线法 （3）组织培养法 适用于分离高等真菌及植物病原菌 高等真菌：如香菇→切1小块菌盖→10%漂白粉消毒处理→无菌水冲洗→置琼脂平板上→培养→长出菌丝体 注意：对蔓延性霉菌： ① 加1%去氧胆酸钠 ② 察氏培养基：0.01%蔗糖， 0.1%山梨糖 2、平皿反应快速检出法——定性或半定量 （1）纸片培养显色法 滤纸饱浸含有指示剂的液体培养基 用接种环接种 保湿恒温培养 据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量 （2）透明圈法 根据琼脂培养上透明圈/菌落直径大小判别目的产物的产量 淀粉平板透明圈：淀粉酶 碳酸钙平板透明圈：产酸 酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶 （3）变色圈法 淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶 支链淀粉平板喷稀碘液： 蓝色圈：异淀粉酶 无色圈：液化型淀粉酶 葡聚糖平板加刚果红：葡聚糖酶 木聚糖平板加刚果红：木聚糖酶 （4）生长圈法 工具菌： 营养缺陷型，不能合成的物质（生长因素）为目的菌积累的产物 菌落形态明显不同于目的菌 方法：106~107 工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌 适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育 （5）抑制圈 适用：抗生素产生菌的选育 工具菌：对目的抗生