微卫星实验的基本操作及常见问题剖析.pptVIP

微卫星实验的基本操作及相关问题 一、实验小结 主要的基本操作依次如下： 1. 提取基因组DNA 2. 设计微卫星引物 3. PCR扩增 4. 琼脂糖凝胶的配制及电泳 5. PAGE检测 6. 数据分析处理 1. 提取基因组DNA 基本步骤 常见问题及原因分析 1）DNA提取量少 材料不佳或量少 裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失 2）DNA有降解或降解严重 组织不新鲜或反复冻融 提取过程中操作过于激烈，DNA被机械打断 未很好抑制内源核酸酶的活性 被外源核酸酶污染 注意事项 1.抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切 力对DNA的损伤 2.离心后，不要晃动离心管，拿管要稳 3.加TE溶解前，DNA不能太干燥 2.设计微卫星引物 目前，本实验室查找微卫星位点常用有两种方法： 实验室鳜鱼转录组数据库 磁珠富集法(FIASCO法) 软件设计,常用的是Primer primer 5.0软件 引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。因此，引物设计需遵循一定的原则。 设计原则： （1）引物长度 PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。引物的长度一般为15-30bp，常用的是18～27bp，但不应大于38bp。 （2）引物碱基构成 引物的G+C含量以40～60%为宜