AFP的检测(1班3组).docVIP

AFP的免疫检测 甲胎蛋白( A F P )主要在胎儿肝中合成,分子量6 .9 万,在胎儿 1 3 周 A F P占血浆蛋白总量的1／3 。在成人,AFP可以在大约80％的肝癌患者血清中升高，在生殖细胞肿瘤出现A FP阳性率为50％。在其他肠胃管肿瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出现不同程度的升高。但当肝细胞发生癌变时，却又恢复了产生这种蛋白质的功能而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。过去一直认为是诊断原发 性肝癌的特异性肿瘤标志物，具有确立诊断、早期诊断、鉴别诊断的作用。近年大量的临床却发现， AFP达到上千，但多年都没有肝癌的迹象；同时发现约20％的晚期肝癌患者，直至病故前，AFP仍不超过10。甲胎蛋白是肝癌的特异性标志，但血清甲胎蛋白阳性未必都是肝癌。在临床中发现，血清谷丙转氨酶升高的患者同时有血清甲胎蛋白升高。 AFP单克隆抗体的制备 单抗的理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，可重复性高，对环境的高度敏感性，弱凝集反应和不呈现沉淀反应，便于人为处理和质量控制并且来源容易。 1、原理：是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫能产生抗体的小鼠脾细胞和能在体外长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞，用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂使细胞融合产生杂交瘤细胞，通过次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）选择基的作用只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养，最终获得既能产生所需单克隆抗体又能长期体外繁殖的杂交瘤细胞系。将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，可从小鼠腹水中得到高效价的单克隆抗体。 2、制备步骤 1)获得抗原：市场上购得商品化AFP,免疫BALB/c小鼠，获得致敏的B淋巴细胞； 2)细胞的选择与融合：建立杂交瘤细胞的目的：是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原(AFP)免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。而另一个细胞则是为了保持融合后的细胞在体外能够长期存活并无限分裂、繁殖，通常选择小鼠骨髓瘤细胞。 细胞的融合是产生杂交瘤细胞的中心环节，使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起，最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇是目前最常用的细胞融合剂，一般的浓度为40%左右。 步骤：将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:2~1:10比例混合，加入PEG，诱导两种细胞融合，时间控制在2分钟以内，再加入培养液缓慢稀释PEG融合液至失去融合作用，融合细胞形成具有2个或多个核的异形体，最终产生杂交细胞。 3）选择培养基 肿瘤细胞合成DNA通常途径有两条：一为生物合成的主要途径，可被叶酸拮抗物（氨基蝶呤）阻断；另为替代途径，叶酸代谢受阻时，细胞通过HGPRT和TK，利用核苷酸前体物合成核苷酸，进而合成DNA。 HAT培养液筛选后，只有具有两亲本细胞双重特性的杂交瘤细胞能长期生存并产生抗体，成为制造单克隆抗体的细胞源。 4）阳性杂交瘤细胞的克隆化培养（有限稀释法） 有限稀释法的原理为将细胞悬液连续稀释，最终至96孔板每个培养孔内平均含一个细胞，培养3~4天后，选择能分泌抗体的单个细胞群落阳性孔，反复多次克隆，获得由单个细胞增殖形成同源性的杂交瘤细胞克隆。 方法：经有限稀释后，将细胞培养至覆盖0%~20%孔底时，吸取培养上清用ELISA测抗体含量，依AFP抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞克隆化，后进行抗原特异的ELISA测定，选出高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。 目前采用液氮保存杂交瘤细胞。细胞放入液氮前，需要逐步降温，如果冻存管放置于-80℃低温冰箱过夜后再放入液氮中，可长期保存。复苏细胞时，冻存管取出后，立即37℃水浴，使之融化。 5）AFP单抗获得（动物体内诱生法） 常选用BALB/c小鼠或与BALB/c小鼠杂交的F1代小鼠为接种动物。接种前一周，在小鼠腹腔内注入降植烷或医用石蜡油0.5ml。接种时，每次向小鼠腹腔注射（0.5~1）×10^6个杂交瘤细胞。接种后10~14天，可分次采集腹水，一只可得10~20ml。将收集的腹水离心去除细胞，灭活（56℃30分钟），再离心，取上清液，加入0.1％℃。 6）单克隆抗体的纯化（亲和层析法） 亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。 ℃过夜，离心取上清，按柱体积1/10