制药分离工程实验指导定稿.doc

四川理工学院 制药分离工程实验指导 第一版 制药工程系 编 二○一二 年 目 录 实验一 细胞SOD的提取和分离 - 1 - 实验二 大枣中多糖的提取分离 3 实验三 有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶 5 实验四 柱层析法对色素的提取与分离 7 实验五 质粒的提取及电泳分离 9 实验六　八角茴香油的提取与检识 11 实验七 秦皮中七叶苷和七叶内酯的提取、分离与鉴定 14 实验八 大孔吸附树脂分离纯化白头翁皂苷 16 实验九 重结晶及过滤 18 实验十 简单蒸馏及分馏 3 实验一 细胞SOD的提取和分离 一、实验目的 1．掌握有机溶剂沉淀法的原理和基本操作。 2．掌握SOD酶提取分离的一般步骤。 二、实验原理 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子(O2-)进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲溶液提取出来。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。 有机溶剂沉淀的原理是有机溶剂能降低水溶液的介电常数，使蛋白质分子之间的静电引力增大。同时，有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，破坏其表面的水化膜，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生聚集，从而沉淀析出。 三、试剂与仪器 1.试剂与材料 新鲜蒜瓣 、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8） 、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5 、丙酮：用前需预冷至4-10℃ 、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2）、0.1mol/LEDTA溶液 、2mmol/L肾上腺素溶液 2. 仪器 恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒 四、实验步骤 1. 组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。 2. SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。 3. 除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。 4. SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60℃热处理15min，得到SOD酶液。 5. SOD活力测定 将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。 试剂 空白管 对照管 样品管 碳酸缓冲液 5.0 5.0 5.0 EDTA溶液 0.5 肾上腺素溶液 肾上腺素溶液 蒸馏水 0.5 0.5 - 样品液 - - 0.5 混合均匀，在30℃水浴中预热5min 肾上腺素溶液 0.5 0.5 加入肾上腺素后，继续保温2min，然后立即在480nm处测定光密度。对照管和样品管的光密度值分别为A和B。 在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即： 酶活力（单位）=2（A-B）N/A 式中，N——样品稀释倍数；2——抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数。 五、实验结果 根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化提取率。 六、注意事项 1. 酶液提取时，为了尽可能保持酶的活性，尽可能在冰浴中研磨，在低温中离心。 2. 肾上腺素容易被氧化，故操作时要尽量快。 以对单糖混合液进行分离。以纤维素作为支持物，把它均匀地涂布在玻璃板上成一薄层，然后在此薄层上进行层析即为纤维素薄层层析。纤维素是一种惰性支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在纤维素上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系 七、思考题 1.计算出每500g大蒜蒜瓣所制备出的SOD酶的克数。 2.讨论有机溶剂沉淀法与盐析法相比的优缺点。 实验二 大枣中多糖的提取分离 一 、实验目的 1、学习多糖的提取分离方法及工艺 2、熟悉萃取、离心、蒸发、干燥等单元操作 3、掌握苯酚硫酸法鉴定多糖的方法。 二 、实验原理 多糖化合物作为一种免疫调节剂，能激活免疫细胞．提高机体的免疫功能，对正常的细胞没有毒副作用，在临床上用来治疗恶性肿瘤、肝炎等疾病。大分子植物多糖如淀粉、纤维素等多不溶于水，且在医药制剂中仅用作辅料成分，无特异的生物活性。而目前所研究的多糖，因其