引物设计预案.ppt

引物设计 自从1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)以来，PCR技术因具有特异、灵敏、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，很快得到了广泛的应用。目前，PCR已经成为分子生物学领域最基本、最重要的技术手段之一。引物设计是PCR技术中至关重要的一环，寻找一对合适的核苷酸片段作为引物，使其有效地从模板DNA序列扩增目的片段，是PCR反应成功的保障。 (1)序列查找和下载。根据拟扩增的基因名称或序列号，在GenBank数据库或其他相关数据库中查找有关核酸序列，然后将其下载。 (2)序列同源性比较。同源性比较主要有两种方法：一是利用在线的NCBI或其他数据库中的BLAST分析工具进行比较，可将第一步查找得到的一条核酸序列与序列数据库中所有相关序列进行比较、(http://BLAST./)，在结果中可以看到所有相关序列(包括同一物种或不同物种、不同长度的同源序列)比较的情况，另外也可利用在线程序(http://BLAST./BLAST/b12seq/wBLAST2.cgi)进行序列之间的两两比较；二是可以将查找得到的相关序列利用OMIGA、PCGENE、DNAMAN等软件进行两两比对或多重序列比较。通过同源性比较，我们可以获知目的基因中高度保守的序列片段，从中选择作为PCR扩增的引物。 (3)引物的设计与筛选。引物的设计与筛选可通过一些分子生物学软件或在线相关工具来完成。目前通常运用软件PrimerPremier 5.0和美国生物医学研究所基因组研究中心提供的一款免费在线引物设计程序Primer 3来设计引物。将目的基因序列输入到上述件指定窗口中，设置一定的参数，运行程序，便可筛选获得若干需要的目标引物。 (4)引物加工与修饰。在设汁引物时，通常根据不同的实验目的，需要对所设计的 引物进行加工修饰，即通常在引物序列的5’端添加一定的附加序列，如酶切位点、保 护碱基、特异性标签、启动子等。 (5)引物的评价分析。检测引物是否存在引物二聚体，错配、发夹结构、退火温度、GC含量、连续的碱基、末端尽量避免是A。 将引物进行Blast比对，检测在该物种中是否有其他位点的错配。 (6)引物的最终评估。将设计并筛选所得的引物进行合成，然后将合成后的引物进行PCR扩增以对其进行最终的评估。一是观察PCR扩增的特异性和效率，经过PCR条件优化后能否获得特异性条带及PCR产物的产量如何；二是观察PCR扩增产物是否与预期产物大小相当；三是观察是否形成引物二聚体带。结合引物最终评估和测序的结果可以对引物设计的成败做出鉴定，为以后进行引物设计积累宝贵经验。 2．引物设计原则 引物设计有3条基本原则：首先，引物与模板的序列要紧密互补；其次，引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；再次，引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度(primerlength)、产物长度(productlength)、序列Tm值(meltingtemperature)、引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability，用AG值反映)、形成引物二聚体duplexformation)及发夹结构(hairpinformation)的能值、在错配位点(falseprimingsite)的引发效率、引物及产物的GC含量(content)等。必要时还需要对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点、引进突变等。主要注意以下几点(张新宇和高燕宁，2004；王艳秋和张培军，1995)。 (1)引物的长度。引物的长度一般为15—30bp，常用的是18—27bp，但应尽量不要大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74~0，不适于TaqDNA聚合酶(Tag酶)进行反应。 (2)引物的特异性。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物应在核酸序列保守区内设计，并且与非特异扩增序列的同源性不要超过?0％或有连续8个互补碱基同源。 (3)引物的碱基分布。引物中4种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，尤其3，端应避免出现3个以上的连续的G或C，如GGG或CCC，否则会使引物在GC富集序列区错误引发。另外，引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响，不同的末位碱基在错配位置会导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。 (4)引物的互补情况。引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，因此应尽可能避免