C18反相硅胶柱的使用.docVIP

各位战友：我现做皂苷类化合物的分离，需要用到C18反相硅胶柱，不知大家有没有这方面的经验，一起探讨．我现有几个问题向大家求教！1. 使用HPLC C18 柱摸出来的条件，走C18反相硅胶常压柱，发现HPLC在某一浓度梯度洗脱下来的东西，恰恰在同一梯度条件下，用反相硅胶常压柱却洗脱不下来，存在很严重的滞后现象，这样一来用HPLC C18 柱摸出来的条件走反相硅胶常压柱根本起不到多大的分离作用．不知大家在走反相常压柱时，其洗脱梯度是如何摸的？怎样解决HPLC和一般常压柱之间滞后问题？2. 在走反相硅胶常压柱时，如何判断某一浓度梯度样品是否完全洗脱完呢？有没有既方便快捷，又有效的方法？可否用正相TLC板来检测呢？3. 在使用反相硅胶常压柱分离皂苷类化合物时，怎样才能使柱子的柱效比较高，不知大家有没有一些小技巧？ 老光头 2007-03-28 18:20 不好意思，还忘了问一个问题：上样量和反相硅胶的比例为多少时，分离效果较好？ 老光头 2007-03-28 18:20 1. 使用HPLC C18 柱摸出来的条件，走C18反相硅胶常压柱，发现HPLC在某一浓度梯度洗脱下来的东西，恰恰在同一梯度条件下，用反相硅胶常压柱却洗脱不下来，存在很严重的滞后现象，这样一来用HPLC C18 柱摸出来的条件走反相硅胶常压柱根本起不到多大的分离作用．不知大家在走反相常压柱时，其洗脱梯度是如何摸的？怎样解决HPLC和一般常压柱之间滞后问题？我们一般用反相C18层析板来摸条件的，。用液相来摸条件太慢了。。而且有一定的差别。可以找绿百草买。2. 在走反相硅胶常压柱时，如何判断某一浓度梯度样品是否完全洗脱完呢？有没有既方便快捷，又有效的方法？可否用正相TLC板来检测呢？呵呵。只能点板拉。没别的办法，又不能单纯看颜色的判断。可以用正相板来检测的。。但如果你的东西是正相一个点，反相几个点的时候一定要小心注意拉。别判断错了。。3. 在使用反相硅胶常压柱分离皂苷类化合物时，怎样才能使柱子的柱效比较高，不知大家有没有一些小技巧？ 柱效高是你装柱的问题，要尽量装紧点，用甲醇冲一段时间，让它压紧。你的是常压柱？那可能会很慢的阿。干嘛不买个蠕动泵加点压阿？4.上样量和反相硅胶的比例为多少时，分离效果较好？一般上样量200-300mg，柱长约50-60cm。。不过我认为这看你的样品斑点的多少来确定把。如果斑点较少，上样可稍多点。总之，鄙人认为反相柱的确是个好东西。我的咚咚基本都用过它来分。用反相柱最重要的是一定要有耐心，绝对急不来的。极性不能加得太大（约是你摸好条件的1/2之比例），不然就功亏一篑了。祝你好运！ 老光头 2007-03-28 18:20 谢谢windy81的建议!反相板太贵了,我们可能用不起哟.不过我还是想问一下,你的用反相板摸条件具体是怎么做的?因为我们从来没有用反相板摸过条件,诚恳不吝赐教! 老光头 2007-03-28 18:20 1、HPLC的柱效在10万以上，不过用的填料粒径在5um，而常用的反相常压柱，粒径40～60um，柱效只有1000，并且速度要慢很多，这就造成楼主说的滞后。解决办法只能靠走反相板，或者根据经验来。Merck的反相板是比较贵，不过你可以每次用甲醇反复展开清洗几次，然后拿来重新用啊。摸条件和走正相板子一样，多尝试一下。2、判断是否走完，点板就可以了。3、装柱最好加压，能加多大压力加多大压力，我们装柱用的是耐压的玻璃柱，装柱压力可以达到7bar，柱效比常压沉降的好很多。4、上样量跟你的柱体积，柱床高度很有关系。如果能加压，反相柱床高度40cm就足够了，上样量根据柱内径来算，原则是摸条件时不超过柱体积的1％，如果分离度很好，可以过载加大上样量。其实皂苷类的化合物用Sephadex LH－20分效果也不错，能够使用的溶剂很宽，不同的溶剂洗脱行为差异很大，而且算下来使用成本比反相硅胶还是要少的，毕竟Sephadex LH－20耐酸碱，在甲醇中能溶胀4倍。 老光头 2007-03-28 18:20 谢谢handson的建议！其实我们的样品用Sephadex LH－20分离了五六次，效果都不怎么样．也不知道是什么原因，但我们发现用Sephadex LH－20分离时，可以除掉其中大量的色素，就是不能将主要样品分开．麻烦handson给我指点迷津，本人不胜感激！ 老光头 2007-03-28 18:20 走反相板好一点儿. 老光头 2007-03-28 18:20 请问各位：我的样品在紫外灯下没有吸收，但是用显色剂显色后，反相板就没有用了．不知在用反相板摸条件时，用什么方法检测样品？诚请大家给我宝贵意见哟！谢谢！ 老光头 2007-03-