分子植病4资料.pptVIP

 基因工程Genetic Engineering 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 基本原理与过程： 　1、分离纯化目的基因 　2、目的基因 + vector =重组DNA分子 　3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。 　4、筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cell clone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。 　5、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。 基因克隆示意图 限制酶 限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。 发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。 限制酶的命名 根据其来源命名。如： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号 EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。 限制酶识别序列和切割形成 每种限制酶能识别和切割的通常4～8个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。 ?  如：Hare Ⅲ 5’-GGCC-3’ ? Bam HI 5’-GGATCC-3` 平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差 　　 切割形成 粘性末端（sticky end）交错切。 部分常用限制酶及切点 核酸外切酶活性 3′→5′外切酶活性 5′→3′外切酶活性 质粒plasmid ?Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。 ? ? PBR322 大肠杆菌 pSC101 ?Plasmid chromosome ? COIEI plasmid 革兰氏阴性菌 pc194 scp12 真核生物-酵母质粒 ? 常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。 ?λ-噬菌体(λphage) 是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌.λ-噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。 改建后的λ噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如： 基因文库 基因文库（gene library）,应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的DNA克隆。  构建基因组DNA文库 cDNA文库（cDNA library） cDNA文库构建： 特定组织细胞一定发育阶段 总 mRNA * * 本章主要内容 切除末端磷酸基 碱性磷酸酶 3′末端多聚尾 末端转移酶 5′磷酸化、探针标记 多聚核苷酸激酶 cDNA合成 反转录酶 探针标记、补平3′末端 DNA聚合酶Ⅰ 生成3′- 5′磷酸二酯键 DNA连接酶 切割DNA 限制性核酸内切酶 常用的工具酶：