章基因结构与功能预案.ppt

DNA链中的核苷酸是以3`，5`-磷酸二酯键相连接，合成DNA所用的底物是2`-脱氧核苷三磷酸（dNTP），在Sanger 双脱氧链终止法中被掺入了2`，3`-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时, 由于它没有3`- OH，不能再与其它的脱氧核苷酸形成3′,5′-磷酸二酯键，DNA合成便在此处终止 在一个PCR测序反应中，以待测样本为模板，加入一条测序引物，四种Dntp,加一种是ddGTP.于是DNA聚会酶催化DNA链的合成。如果反应碰到模板C碱基的时候，这时候就有两种可能了，dGTP掺入，链可以继续延伸。如果ddGTP掺入，该链就终止了！！反应结束时候，该反应体系中含有长短不同的以G为结尾的DNA片段。都有共同的起点，其长度取决于ddNTP掺入的位置与引物5’端之间的距离。 那么在四种反应体系中，也就是四个不同的反应管中加入四种不同的ddNTP底物，就会得到终止于特定碱基的一系列寡核苷酸片段。 目录 目录 第22章 基因结构与功能分析技术 The Analysis Technology for Gene Structure and Function 第一节 基因结构分析技术 第二节 通过检测RNA而在转录 水平分析基因表达 第一节 基因结构分析技术 一、基因的一级结构解析技术 DNA序列测定（DNA sequencing） （二）四色荧光全自动DNA测序技术 一、 DNA序列测定（DNA sequencing） 基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序，分析一级结构最精确的技术就是DNA测序。 3’-5’磷酸二酯键 不能与下一个脱氧核苷酸结合! （一） Sanger 双脱氧末端终止法 最早的 测序方法 （dideoxy sequencing） 单脱氧核苷酸（dNTP) 双脱氧核苷酸(ddNTP) 背景知识 H H H Sanger：1977年建立了双脱氧链终止测序法。 获得了诺贝尔化学奖。 （一） Sanger 双脱氧末端终止法测序的原理 （dideoxy sequencing） 背景知识 在PCR反应体系中，如果只加入一对引物中的一种引物，结果是什么？ 单引物只能使一条DNA链被扩增 扩增的产物是包含引物的单链DNA 不对称PCR (asymmetric PCR)： 是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA). DNA聚合酶 Template Primer New strand Sanger双脱氧末端终止法原理 1. 测序PCR： each plus one kind of ddNTP. Set up 4 PCR reactions: DNA pol. ； primer； dNTPs； 3. 变性聚丙烯凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE) 分辨仅差一个核苷酸长度的DNA片段 2. 得到终止于特定碱基的一系列寡核苷酸片段 dNTPs ddNTPs DNA聚合酶 Template Primer New strand * PCR反应时仅加入一种引物， * 底物中添加ddNTPs，利用双脱氧核苷酸终止新链的延伸 * 从而获得在任何一个核苷酸上随机终止的一系列长度不同的DNA片段。 *变性聚丙烯凝胶电泳分辨仅差一个核苷酸长度的DNA片段 100 : 1 小结： 双脱氧末端终止法测序的原理 （dideoxy sequencing） H H H Sanger双脱氧末端终止法 缺点： Sanger双脱氧末端终止法 手工测序 泳道间迁移率有差异，对测序的精确性有一定的影响 放射自显影条带较宽，读序列困难 全自动四色荧光DNA测序 （二）全自动四色激光荧光DNA测序 原理：基于sanger双脱氧法 第一代被广泛使用的测序技术。 实现制胶、上样、电泳、检测数据分析全自动化。 测序长度可以超过1000bp，准确率可达到99.999% 不同颜色荧光标记的四种ddNTPs， 四色荧光法 赋予DNA片段4种不同的颜色 只需做一个PCR反应。 在一个泳道内电泳 自动化的毛细管电泳 DNA测序仪：其实它就是将测序PCR产物进行PAGE，电泳时激发出四色荧光，并进行软件分析。 四色荧光法 （三）焦磷酸测序法：了解 焦磷酸测序是一种可行的方法 特点： 测序长度短于sanger法、操作简单(高通量分析)、结果可靠。 单核苷酸多态性位点（SNP)分析 等