真核细胞DNA提取预案.pptVIP

真核细胞DNA的提取 二、实验原理： 　　 　　核酸分子是基因工程研究的主要对象。核酸样品的质量直接关系到基因研究一系列试验的成败。 　　核酸包括脱氧核糖核酸DNA 和核糖核酸RNA 两种分子。 在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。由于，脱氧核糖核蛋白与核糖核蛋白在电解质溶液中溶解度明显不同，据此可将二者分离。 植物细胞经过充分冷冻，细胞核在研磨时容易破裂，利于提取ＤＮＡ．ＤＮＡ在低温下易于凝集。　　植物总 DNA 的抽提常采用两种方法： SDS 法和 CTAB 法。 CTAB 法：简便、快速， DNA 产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种非离子去污剂，植物材料在 CTAB 的处理下，结合 65℃ 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、 DNA 被释放出来。 CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐（ 0.7mM ）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（ 0.1 ～ 0.5mM NaCl ）下， CTAB- 核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后， CTAB- 核酸复合物再用 70 ％ ～ 75% 酒精浸泡可洗脱掉 CTAB 。再经过氯仿 / 异戊醇（ 24:1 ）抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化 DNA ，最后经异丙醇或乙醇等 DNA 沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。 SDS 法：过程长，纯度高。阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）能破坏细胞膜，并能解聚脱氧核糖核蛋白复合物（DNP），使DNA从脱氧核糖核蛋白中释放出来。 SDS使脱氧核糖核蛋白中的组蛋白分离变性形成沉淀，从而得到纯净的DNA。利用DNA不溶于乙醇等有机溶剂的特点将DNA沉淀下来。　　 1.仪器 各量程微量移液器；研钵；水浴锅；离心机； 液氮贮存装置；制冰机；天平 2.试剂及相关耗材 各式微量移液器枪头；Dorf管；SDS 提取缓冲液 （ 100mM Tris-HCl ， pH8.0 ； 50mM EDTA ， pH8.0 ； 0.5M NaCl ； 10mM β- 疏基乙醇，使用前加入）； 20 ％ SDS ； 5M KAc ； CTAB 提取缓冲液（ 2% CTAB ， 1.4M NaCl ， 20mM EDTA ， 100mM Tris-HCl ， pH8.0 ） ； 氯仿 / 异戊醇（ 24:1, v/v ） ； 4M NaCl ；无水乙醇； 75% 乙醇； TE 缓冲液。 一） CTAB 法提取桉树叶片 DNA 1 ．植物组织的破碎：取 0.2-0.4g 新鲜的桉树叶片，在液氮中研磨至粉末状，转入 1.5ml 离心管中。 2 ．细胞的破碎：迅速加入 1ml 预热（ 65 ° C ）的提取缓冲液， 65 ° C 水浴中保温 30min 以上，每 5 min 上下颠倒 1 次。 3 ．核酸的分离： 12000g 离心 5 min ，吸取上清液约 600μl ，加入等体积氯仿 / 异戊醇（ 24:1 ），上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。 4 ． 12000g 离心 5 min ，取 450μl 上清于一新 1.5ml 离心管，加入 1ml 95% 乙醇和 45μl 10M NH 4 Ac ，混匀，室温放置 10min 。 5 ． 12000g 离心 10min ，去上清，用 75% 乙醇浸洗沉淀，自然干燥约 30 min 。 6 ．核酸的溶解：加入 50μl TE 或无菌水（含 20μg/ml RNase ），置于 4℃ 过夜，待 DNA 溶解后，检测 DNA 浓度及质量。 ７．核酸的纯化：加入等体积的异丙醇室温下沉淀 DNA ；用 70% 的乙醇清洗沉淀；沉淀经室温干燥后溶于 500 m l TE缓冲液中。 5 ． 4℃ 下 12000g离心 15 min ，取上清至新管，加入等体积的氯仿 / 异戊醇（ 24:1 ）抽提，轻轻颠倒数次，放置片刻。 6 ． 4℃ 下 10000g 离心 10 min ，吸取上层水相到另一离心管中，加入 2/3 体积 -20℃ 预冷的异丙醇，混匀，室温静置 30min ，观察沉淀生成。 7 ． 4℃ 下 8000g 离心 10 min ，倾去上清液，用 75% 的乙醇洗涤沉淀，吹干。 8 ．用 100μl TE 充分溶解， -20℃ 存放备用。 DNA提取常见问题 1 ．核酸 DNA 分子对机械力十分敏感。因此操作过程中动作应尽量轻柔， 转移用的枪头最好是剪过的， 避免剧烈振动可获得较长的 DNA 分子。 2 ．尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用 10mM 的 β-ME 处理。 3 ．所用试剂必需灭菌，带手套操作。 4