实验方案(最终版).docVIP

实验方案的制定 （一）实验名称：蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法 （二）实验时间：第14-15周 （三）实验地点：生命科学学院 实验楼307或其他实验室。 （四）实验人员：邓泰濠，何国杰， （五）实验目的： 学习并掌握考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量。 学会使用721或722型分光光度计 （六）实验材料 取材：燕塘牛奶 仪器设备：100ul微量进样器，2个枪头，可见光分光光度计，1ml移液管3支，2ml移液管2支，试管11支，25ml容量瓶1个，旋涡混合器离心机，1支5ml移液管，3个洗耳球G—250染料试剂，无离子水 考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升. 标准蛋白质溶液：牛血清白蛋白（BSA）（电泳纯）用0.15 mol?L-配制0.15mol/L NaCl，pH=7的磷酸缓冲液 无离子水 （七）实验方法： 1、蛋白质标准曲线的制作 2提取：将燕塘牛奶倒在25ml容量瓶中，摇匀。 3.按顺序滴加各途中溶液。 4..测量分光光度值； 5..制作标准曲线 （八）实验过程： （1）取BSA标准溶液（1mg/ml）各0、20、40、60、80、100ul于不同试管中（蛋白质含量分别为0、20、40、60、80、100ug），不足100ul的用0.15 mol?L-1 NaCl调至100ul。于以上试管中加入5ml蛋白质试剂，混匀。2min后各取2～3ml于3ml比色杯中，以空白作为对照，用分光光度计测定595nm的吸收值。 管 号 空白 1 2 3 4 5 1mg/ml BSA（ul） 0 20 40 60 80 100 0.15M NaCl (ul) 100 80 60 40 20 0 总体积（ul） 100 100 100 100 100 100 相当蛋白质含量(ug) 0 20 40 60 80 100 G-250（ml） 5 5 5 5 5 5 OD595 （2）取8支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，用蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.2、0.6、0.8、1ml，然后用无离子水补充到2ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第6、7、8管。 （3）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即2mlH2O加5.0mlG—250试剂。 注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 （4）以各试管加牛奶的量（ml）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 （九）实验结果：准确记录计量观察指标的实验数据和定性观察指标的实验变化。 燕塘牛奶（ml） 0 0.2 0.6 0.8 1.0 未知样品(ml) 0.2 0.6 0.8 蒸馏水(ml) 2 1.8 1.4 1.2 1 1.8 1.4 1.2 考马斯亮蓝 G－250试剂(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 OD(595) 2.作出标准曲线，并在表中查出未知牛奶蛋白质溶液。 （十）结果分析：每次实验结果应做必要的数据处理和分析，并有明确的文字小结。 （十）实验环境：按记录本上要求，记录当天的天气情况和气候（温度、湿度）。 （十）G—250染料试剂，无离子水 考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升. （七）实验方法： 1.提取：将维他奶牛奶倒在25ml容量瓶中，摇匀。 2.按顺序滴加各途中溶液。 3.测量分光光度值； 4.制作标准曲线 （八）实验过程： （1）取8支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，用蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.2、0.6、0.8、1ml，然后用无离子水补充到2ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第6、7、8管。 （2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品