Chapter人类染色体作图说课.ppt

* * 3．STR标记（简单序列重复） 短串联重复序列（short tandem repeat） 　　STR标记又叫微卫星DNA标记（SSR ），它是指基因组中存在的由2-6个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，广泛分布于真核生物基因组中。 * * 特点： ①? 高度多态。 ②? 高频率性、分布广、平均分布。 ③? STR两侧有特异性单拷贝顺序。 ④? 相对容易进行PCR 微卫星已成为取代RFLP的第二代分子标记 * * * * 微卫星DNA PCR扩增结果（示例）： 500bp 400bp 300bp 240bp 该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4种。 微卫星DNA差异最小只相差2个碱基（重复片段只有2个碱基）。 * * 第三代分子标记：SNP(single nucleotide polymorphism) 　单核苷酸多态性 SNP就是指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的核苷酸，且其出现频率大于1%。指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入. 1996年美国E.S.Lander提出，称为第三代DNA遗传标记 * * AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCT AATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCT AATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT 个体A 个体B 个体C SNP分布于整个基因组，可在基因内，也可在基因间。估计每1300个bp存在一个。 　　在人类DNA序列变异中，SNP占90%。 单个碱基的插入和缺失不认为是SNP。目前已知基因组中含有150万个SNP * * 三、人类基因组的物理作图法 以特定的DNA序列为界标直接排列在基因组DNA分子上，这些特定的DNA序列可以是多态的，如RFLPs，但主要是非多态的。 图上界标之间的距离以物理长度来表示，即以核苷酸对的数目来表示。 　 最精细的物理图就是基因组的全序列图。（physical map） * * 非多态的短、单一序列 单拷贝的，长度为300bp左右（200-500）的单一序列： 顺序标签位点（sequence tagged site ,STS），是基因组中的单一DNA序列，只出现一次，易于PCR扩增和检测。 表达序列标签（expressed sequence tags,EST），是某一cDNA分子的特有的一段DNA序列，可作为遗传标记和检测检测基因组中的编码序列。 * * 物理作图基本方法 1．由长到短作图（top-down maping） (1) 完全酶切 (2) 先长切，用识别顺序少的限制酶，100-1000 Kb 再短切，用识别顺序多的限制酶，酶切长片段。 (3) 连接 优点：汇成的图谱比较完整 缺点：不够精细，分辨率较低 * * [例]一个线状DNA分子，用两种限制性内切酶酶切，结果如下： BamHⅠ 8.0, 7.5, 4.5, 2.9 Kb BglⅡ 13, 6, 3.9 Kb BamHⅠ+ BglⅡ 7.5, 6, 3.5, 2.9, 2, 1 Kb 请画出这个线状DNA的限制酶谱 Bg Ⅲ 3.5 1 BamH Ⅰ 2.9 Bg Ⅲ 6 2 BamHⅠ 7.5 Bg Ⅲ 6 2 BamHⅠ * * 2.由短到长作图（bottom-up maping） 用有很多识别序列的限制性内切酶通过减少酶量，缩短反应时间，作部分酶切（partial digestion）。特点是一些片段相互之间有重叠部分，因此部分酶切的片段两两连接，逐渐延长片段。 优点：分辨率较高，比较精细； 缺点：短片段易丢失，连接时可能出现空挡（gap） * * 部分酶切 * * 用内切酶把总DNA切成不同长度的片段（VNTR上没有酶切位点），再以VNTR中的特殊序列为探针进行Southern杂交，由于不同个体的这种串联重复的数目及位置不同，所以VNTR的Southern杂交谱带具有高度的个体特异性，故又称其为DNA指纹（DNA fingerprints）。 * 这种界标在人基因组中可多达300万个，平均1300bp就会有一个。这种界标数目极多，覆盖密度大，可以大大提高基因组作图和基因定位的精度。 * * 1、克隆基因定位法（p91） 采用已克隆基因的cDNA探针与保留在杂种细胞内的人染色体DNA酶切序列进行分子杂交，来确定克隆基因所在的染色体。 (三）DNA介导的基因定位（核酸探针方法） * * 以人体白蛋白基因cDNA为探针的克隆