HBV的分子检测.说课.pptx

HBV的分子检测;;;基本介绍;地域分布;地域分布;浙江大学毕业生，在当地政府录用公务员时被拒绝，因而刺死一名人事干部并致另一人重伤。;普及乙肝知识，减少恐慌 国家是规定不准检查乙肝，单位或医院不能未经当事人查看乙肝。 积极开发治疗乙肝药物;;Real-time PCR 多重PCR 巢式pcr PCR-RFLP ;原理：指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。;在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。;PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 ;上游引物： TGGATGTGTCTGCGGCGTT （19bp） 下游引物： GATGATGGGATGGGAATACA（20bp） B型探针：5′-FAM-TCATCTTCCTCTGCATCCTGCTG-TAMRA-3′(23bp)（B管） C型探针：5′-FAM-CTACTTCCAGGAACATCAACTACCA-TAMRA-3′（25bp）（C管）;如C管Ct≤36，B管Ct=40则HBV的基因型为C型； 如B管Ct≤36，C管Ct=40则HBV的基因型为B型； 如C管和B管均Ct≤36，则HBV的基因型 为B/C混合型； 如C管和B管均Ct=40，则为B、C外的其他型；或HBV-DNA含量小于本方法的检测下限。 ;;又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同.;①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多个型别的目的基因进行分型。 ②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌。 ③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省成本。;HBV分型检测;是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两??PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。;巢式pcr;;聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析。 ;概念;HBV分型检测;HBV分型检测;;高精度乙肝病毒（HBVDNA）定量检测技术是国家“十二五”乙肝临床诊断《乙型病毒性肝炎临床诊断及监测技术的研究》项目成果。 优点：较现有国内技术高50-100倍，避免以往常出现的“假阴性”和漏检情况，可用于抗病毒治疗患者治疗终点的确认、复发再治的判断以及隐匿性病毒性肝炎的诊断。 ;Thanks for your attention