细胞生物学实验技术研究报告.ppt

3.下列哪一项与显微镜的分辨率无关（ ） A．光波波长 　 B．标本和透镜之间的物质的折射率 　 C．透镜的数值孔径 D．物镜放大倍数 4．普通光学显微镜用油镜观察时镜油应该加在哪个部位? A．标本上 B．物镜上 C．标本和物镜之间 D．目镜上 D C ?生物化学与分子生物学技术 细胞化学技术 免疫细胞化学 显微光谱分析技术 分子杂交技术 PCR技术 1.物理固定：如冷冻切片。 （一）细胞化学技术 固定 目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来。 2.化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细胞结构和其中的某些化学物质加以固定保存。 显示方法 金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 Schiff反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。 联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 茚三酮反应：显示蛋白质。 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显色方法 （二）免疫细胞化学 免疫细胞化学是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的γ球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。 （三）显微光谱分析技术 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。例如，核酸的吸收波长为260nm，而蛋白质的则为280nm。某些成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定。 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。 1.原位杂交 用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。 （四）分子杂交技术 人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 2.Southern杂交 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 （五）PCR技术 1. 原理 PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）,它是利用DNA 双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。 2. 过程 高温变性（90~95℃） 低温退火（55~60℃） 中温延伸（70~75℃） 双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。 多次重复 3.特点：指数形式扩增 ?离心技术 差速离心 密度梯度离心 ?细胞培养与细胞工程 体外培养的3个环节： 营养 生存环境 废物的排除 ?动物细胞培养 类型：原代培养细胞（1－10代） 传代培养细胞（传10代左右），出现危机， 大部分衰老死亡，少数继续。 细胞株：再传40－50代次，正常二倍体，接触抑制。 细胞系：亚二倍体或非整倍体，接触抑制丧失 植物细胞培养 原生质体培养：体细胞培养，培养脱壁后的细胞，特点： 比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA； 便于进行细胞融合，形成杂交细胞； 适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。 单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。 外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。 细胞融合与杂交 植物细胞先去壁； 融合方式：仙台病毒或聚乙二醇介导，电融合等 同核融合细胞，异核融合细胞，染色体丢失 单克隆抗体技术 1975年英国科学家Milstein and Kohler, 1984年获诺贝尔奖 B淋巴细胞 + 小鼠骨髓瘤 * * * * * * * * * * * *