chapter1蛋白质section1摘要.ppt

氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。 NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。 ★ ★ ★ 4.氨基酸的化学性质 (1)与茚三酮的反应（颜色反应） OH OH 反应要点 A.该反应由NH2与COOH共同参与 B.茚三酮是强氧化剂 C.该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值 D. 测定范围：0.5~50μg/ml E.脯氨酸（或羟脯氨酸）与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3） 应用： A.氨基酸定量分析（先用层析法分离，再测定CO2的量） B.氨基酸自动分析仪： 用阳离子交换树脂，将样品中的氨基酸分离，自动定性定量，记录结果。 反应特点 A.为α- NH2的反应 B.在常温，中性条件，甲醛与α- NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。 应用：氨基酸定量分析—甲醛滴定法（间接滴定） (2)与甲醛反应 氨基酸的甲醛滴定 氨基酸两性离子的NH3+是弱酸，其pKa为9.7左右，完全解离时溶液的pH约为10±，超出酸碱滴定指示剂的显色范围，不能用一般指示剂，例如酚酞，作酸碱滴定。但当氨基酸的氨基与中性甲醛结合成氨基酸二羟甲基衍生物后，其氨基的碱性即大大减少，反应向右进行，两性离子中NH3+基的离解度增加，释出H+质子，NH3+的pKa值降低到6.5左右，溶液的pH降至6.7左右，此时NH3+离解释出的H+即可以酚酞作指示剂用标准NaOH溶液加以滴定。每释出的一个H+就相当于一个氨基酸。甲醛滴定可用来测定蛋白质的水解程度。 当氨基酸溶液中存在1mol/L甲醛时，滴定终点由pHl2左右移至9附近，亦即酚酞指示剂的变色区域。这就是甲醛滴定法的基础。 小结： A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。 B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。 C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1） D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。 (3) 与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应 反应特点 A.为α- NH2的反应 B.氨基酸α- NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃) C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸 应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸 A.虽然多肽侧链上的ε- NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，容易 与α- DNP氨基酸区分和分离（α- DNP氨基酸可溶于有机溶剂，而R基的 DNP衍生物则不能，因此，可用有机溶剂抽提） 黄色 ★首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构 A. B.用酸水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸 C.分离DNP-氨基酸 D. 肽分子与DNFB反应，得DNP-肽 层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目 Sanger降解法的改进方法--- DNS-Edman降解法 用DNS(二甲基氨基萘磺酰氯)测定N端氨基酸 原理DNFB法相同 但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定 由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Sanger法高几到十几倍 可用于微量氨基酸的定量 由Edman于1950年首先提出为α- NH2的反应用于N末端分析，又称Edman降解法 Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。 (4)与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应 苯氨基硫甲酰肽 噻唑啉酮苯胺 苯乙内酰硫脲AA 肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽 环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少 一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨 基酸 分离PTH-氨基酸 层析法和HPLC等鉴定 用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链 灵敏度提高，能连续测定。 多肽顺序自动分析仪 样品最低用量可在5pmol （5）侧链R基参加的反应 氨基酸的侧链基团R有下列几种： 苯环(苯丙氨酸及酪氨酸) 酚基(酪氨酸) -OH基(丝氨酸、苏氨酸) -SH基及—S—S—键(半胱氨酸及胱氨酸) 吲哚基(色氨酸) 胍基(精氨酸) 咪唑基(组氨酸) 重要反应： A. 与酰化试剂反应：如丹磺酰氯；为α- NH2的反应 B. 精氨酸的反应：胍基与1，2－环已二酮；防止胰pro酶对Arg的－　　 　　　　　　　　　 COOH所生成的肽键的水解 C. Cys与乙撑亚胺的反应：－SH的反应；为胰pro酶提