非变性胶割胶纯化预案.ppt

非变性胶割胶纯化详解 广西大学生命科学与技术学院 冼亮 目的蛋白质的定位 首先要知道目的蛋白质的位置才能切割凝胶，但蛋白质在非变性胶中的电泳行为受分子量大小、分子形状、电荷的影响，对于从没跑过非变性胶电泳的蛋白质，是不存在商业用的标记的。一般有两种方法可用来指示： 一、显色法 适用于存在显色方法的蛋白质，如α-淀粉酶能通过降解平板上的淀粉-曲利苯蓝复合物产生降解区来显色。或者其它酶降解底物可引起pH值的变化造成指示剂变色。 二、用较纯的目的蛋白质为标记 适用于显色较麻烦或根本不能显色的蛋白质。常见的情况为倾尽所能所得到的目的蛋白质纯度仍达不到要求，但该样品跑非变性胶却能分出不止一条带，在确认了目的蛋白质所在的条带后就能仅切割该条带，得到纯度更高的蛋白质。 样品的电泳 要在保持目的蛋白质活性的前提下确保其可以与杂质蛋白质分离，且最好不拖带和条带弥散，要确定以下因素 ： 浓缩胶和分离胶的浓度，是否要全程保持低温、电压电流、电泳时间等。 本人的实验操作实例 电泳 垂直电泳，浓缩胶5%，分离胶12%，电压不高于110伏特，电流不高于50毫安，电泳过程有冰水来冷却，电泳3小时（此时溴酚兰和一部分杂质蛋白质已跑出凝胶）。 切割凝胶 实验桌面上平铺一个保鲜袋并标上数字，将凝胶平放，手术刀和尺子消毒。 切开第1和10泳道，在切开的时候要横切几刀作为标记，因为凝胶染色和脱色之后尺寸可能会变化。 第1和10泳道拿去染色之后就成了这样（上图），为了防止凝胶水分挥发，需要在表面覆盖一个保鲜袋（下图）。 染色液和脱色液 染色液和脱色液装在直径为9cm的培养皿中，培养皿壁上贴上标签写明编码。 在摇床上染色约20min 脱色前用清水洗去胶条上残留的染色液 在摇床上脱色至目的蛋白质条带清晰可见 凝胶放置在白色底板上以增强颜色对比效果，使蛋白质条带更易于辨认。将脱色后的胶条中含有目的蛋白质的切割区间与未染色的凝胶中相应区间按照比例相互对应，推断出未染色的凝胶中含有目的蛋白质的大致位置。 将未染色凝胶中含有目的蛋白质的部分切割 研磨凝胶至尽可能碎（所用器具需灭菌）后放置在4℃ 多次浸泡提高蛋白质得率 切胶回收效果图 第一泳道为回收后所得蛋白质，后面的都是样品。怎么样，效果很好很强大吧？哦，骚年们，还犹豫神马，欲练神功，挥刀自切吧！很简单的哦。 * *