第三章细胞生物学研究方法说课.pptVIP

第三章 细胞生物学研究方法 工欲善其事，必先利其器。 ——《论语.卫灵公》 第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞组分的分析方法 第三节 细胞培养、 细胞工程与显微操作技术 第四节 用于细胞生物学研究的模式生物 第一节细胞形态结构观察方法 一、光学显微镜技术（light microscopy） 二、电子显微镜技术(Electro microscopy) 三、扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope ) 1、普通复式光学显微镜 显微镜的结构 分辨率：能分辨被检物体细微结构最小间隔的能力。 D= 2、相差显微镜 相差显微镜利用光的干涉现象将光程差或相位差转换成振幅差（物镜后装有相差板），观察活体材料及细胞器、细胞核的动态。 3、微分干涉显微镜 利用平面偏振光。偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器或大颗粒的运动 4、荧光显微镜 对特异蛋白质等生物大分子定性定位研究。 以超高压汞灯为光源，发射紫外光和蓝紫光，照射物体使之发出荧光，在显微镜下观察物体的形状、位置，还可观察活体。显微镜安装了激发光滤片和阻断滤片。 荧光显微镜技术包括荧光素直接标记技术和免疫荧光技术。 荧光显微镜 5、暗视野显微镜  6、倒置显微镜 物镜和照明系统位置与普通显微镜相反，用于观察培养瓶或皿中的活细胞。 7、激光共聚焦扫描显微镜 物镜和聚光镜共焦点。排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率。用激光作光源，通过改变焦点获得光学切片。 分辨率高，30nm，可观察立体三维结构，用于研究亚细胞结构与组分的定位及动态变化。 8、荧光共振能量转移技术 检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的技术，可检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接作用（距离小于10nm）。 原理：利用受体蛋白YFP能否接收供体蛋白CFP发出的荧光并被激发，测定目的蛋白的距离。 例：水母素与绿色荧光蛋白。 9、荧光漂白恢复技术 使用与蛋白质或脂质耦联的亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等，检测活体细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。 原理：利用高能量激光束的照射使特定区域的荧光发生不可逆的淬灭。光漂白区荧光的恢复可通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞质中运动至漂白区来完成。 例如膜脂分子或膜蛋白的流动性。 当代显微镜的发展趋势 二、电子显微镜技术 1、电子显微镜与光镜的区别 2、电镜的基本构造 3、电镜制样技术 1、电镜与光镜的区别 2、电镜的基本构造 3、透射电镜制样技术 （1）超薄切片技术 40—50nm （2）负染技术 （3）冷冻断裂和冷冻蚀刻技术 （4）电镜三维重构技术 1、 取材：快速、低温、体积小 2、固定：保持样品的真实性。 单一固定剂不能固定细胞内所有组分，常需联合使用不同固定剂。常采用戊二醛和四氧化锇双重固定。 3、脱水：梯度乙醇或丙酮。 由于常用包埋剂是非水溶性的，只有将细胞中的游离水分彻底清除之后，非水溶性的包埋剂才能渗入。 4、包埋:环氧树脂、丙烯酸树脂。 脱水后将样品包埋在树脂中，使之获得一定的硬度、弹性和韧度，这样才易于切成超薄切片，并使切片能承受电子束轰击。 5、切片:厚度40---50nm。在超薄切片机上进行。 6、染色： 染色目的：增强样品中各种结构图象之间的反差或选择性地显示某些结构或成分。 染色方法：采用醋酸双氧铀（细胞核、结缔组织）——柠檬酸铅（细胞质）双染法。 负染技术 某些生物样品不用切片，直接观察，如核糖体、病毒、蛋白质纤维等。此方法结果是样品本身染色很浅，而周围的载网颜色很深，将样品的精细结构衬托出来。这种染背景而不染样品的方法叫负染。 用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 冷冻蚀刻电镜技术 主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 标本置于液氮或液氦中冰冻。然后低温断裂，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复型（replica）。 电镜三维重构技术 4、扫描电镜技术 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 工作原理：是用一束极细的电