第五章PCR研讨.pptVIP

聚合酶链式反应（PCR） 第五章 一、基因扩增 概念：指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。 有下列五种方式： 1. 环境诱发扩增 2. 基因的程序性扩增 3. 基因组进化扩增 4. 基因工程扩增 5. PCR扩增 1.环境诱发扩增 在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。如氨甲 喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。 2. 基因的程序性扩增 在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。如非洲爪蟾 卵子形成过程中rRNA基因的扩增。 3. 基因组进化扩增 生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果 相关的基因聚集成簇。 4. 基因工程扩增 载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。 5. PCR扩增 应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。 二、PCR技术Polymerase Chain Reaction 1. PCR的发明 （1）1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。 （2）1985年Cetus公司的科学家K.B. Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实。Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。 （3）Taq DNA 聚合酶 1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反应中。使 PCR自动循环仪成为可能。 （4）PCR 仪 1988年 Cetus公司发明自动热循环仪。1986年 H.A. Erilish从嗜热 水生菌分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 ℃ )，PCR技术才进入实用阶段。 2. PCR技术的原理： （1）DNA模板变性 双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。 （2）DNA模板与引物复性 引物（primer）:人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。40-65℃ （3）DNA链的延伸 DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。72℃ （4）1个循环的结果 （5）新一轮循环开始：变性—复性—延伸。理论上30次循环 3. PCR的过程 （1）第一步：变性（denature） 94-95℃下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。 （2）第二步：复性（anneal） 50-60 ℃下1分钟，引物优先与模板复性。 ① 引物的浓度高， ② 引物的链短。 （3）第三步：延伸（extend） 72 ℃下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。 （4）第四步：变性（denature） 94 ℃下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。 （5）第五步：重复（repeat）30-35个温度循环 4. PCR的特点 （1）特异性强 ① PCR使用专门合成的DNA引物。 ② 延伸过程是在高温下进行。这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。 （2）敏感性高：需要模板量极低，理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109 （3）快速：整个PCR过程约2-3小时即可完成。 （4）简便：对模板的纯度要求低。不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。 （5）可以扩增mRNA （RT-PCR） 先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。 5. 影响 PCR的因素 （1）Taq DNA聚合酶 自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 ℃ )，PCR技术才进入实用阶段。 ① 热稳定性 Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。 ② 最适温度高 最适温度： 75-80 ℃ 延伸速度： 约35-150nt/s.酶分子 最长延伸长度：6.7kb ③ Taq酶的功能缺点 具有5’?3’聚合酶活性和5’?3’外切酶活性，但没有3‘?5’外切酶活性。 因此不能修复错误的碱基配对！合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。 ④ Taq DNA聚合酶的激活剂 金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。50mmol/L KCl也能激活T