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第五节 目的基因与载体DNA的连接 目的基因与载体DNA连接的方式 平端连接：难度大，需酶量多 黏端连接：容易一些，常用。 人工接头： 大肠杆菌DNA连接酶 不能连接平末端,连接效率低. * * pSC101 抗四环素 pR6-5 抗卡那霉素 DNA连接酶 重组DNA分子 EcoRI 抗卡那霉素基因 目的基因 整合在宿主细胞染色体DNA中 独立于宿主细胞染色体DNA外 （独立的复制子功能） 基因载体 限制性内切酶酶切 酶切 磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶 目的基因与载体的连接 连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 粘端连接 CCGG CCGG GGCC GGCC CGG C C GGC CGG C C GGC CCGG GGCC HapⅡ T4-DNA连接酶 平端连接 AGCT TCGA AluⅠ DNA连接酶 AGCT AGCT TCGA TCGA 同聚物加尾连接 5’ 5’ 5’ 5’ AAA AAA TTT TTT TdT酶 连接酶 人工接头连接 BamHI BamHI BamHI T4-DNA连接酶： T4-噬菌体 连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm） ≤15℃： 15℃/6h； 12℃/8h； 8℃/12h； 基因载体 目的基因 质粒 噬菌体 病毒 PCR cDNA 人工合成 基因文库 限制性内切酶 有切口的载体 有切口的目的基因 DNA连接酶 重组体 转化 转染 体外包装 带重组体的宿主细胞 表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法 目的基因的表达
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