第五章连接转化研讨.ppt

第五章 载体和靶基因的重组和转化 第一节载体和靶基因的重组 粘端和平端连接 PCR产物同T载体的连接 Ligation Temperature Quick Ligation Reaction Buffer Ligation time To set up a ligation reaction 2X Quick Ligation Reaction Buffer 5μl Vector 50ng Insert ? T4 DNA Ligase 1μl H2O to 10μl PCR产物同T载体的连接 第二节转化大肠杆菌 感受态大肠杆菌制备 感受态大肠杆菌制备 感受态细胞（competent cell）概念 转化大肠杆菌 Do transformation with competent cells Do transformation with competent cells Transformation control set-up Negative control: Only vector for ligation in the ligation mixture If no control? H2O 950 ml bacto-tryptone 10g bacto-yeast extract 5g NaCl 10g 5 mol/L NaOH pH7.0 Agar 15g H2O to 1L Cool to 50℃ 60μg/ml AMP plate 教学要求 我们又分…… 催化粘端……. 快速连接反应液……这是连接温度选择 在进行连接反应时，如何选择连接时间哪？ 这是一个快速连接反应动力学图，经过5min连接，反应已完成，延长时间也不能增加转化克隆数目，这是运用快速连接buffer时，选用5min连接时间的原因。在实践中，选哪种连接体系由各个实验室…. 在连接反应中，插入和载体的用量如何确定呢？为增加载体和靶基因接触和连接的机会，摩尔比 T载体上加的T尾就是为了同A尾巴配对 除了克隆载体可改建为T载体，表达载体也可改建为T载体 如何把连接好的重组子 * 第二节转化大肠杆菌 第一节载体和靶基因的重组 DNA连接酶 DNA连接酶 平端和粘端连接 Cohesive ligation:10-16 ℃ Blunt ligation:15-20 ℃ 16℃ 25℃: Quick Ligation? Kit 2X Quick Ligation Reaction Buffer: 132 mM Tris-HCL 20 mM MgCl2 2 mM dithiothreitol 2 mM ATP 15% Polyethylene glycol (PEG 6000) pH 7.6 @25°C Regular ligation buffer: Overnight Rapid ligation buffer: 2,000,000 units/ml: 5min Dynamics of rapid ligation reaction Insert:vector ratios vector : 1-10 μg/ml (1-10ng/μl) Insert: vector =2-6:1 Vortex and spin 5 s， 25°C 10μl 大肠杆菌转化 感受态：细胞经过一些特殊方法（如CaCl2法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。 CaCl2 特殊处理 受体细胞(DH5α) 细胞膜特性改变 Place culture on ice for 10 min Protocol for competent cells preparation Do transformation with electroporation 5 ?l ligation mixture 50 ?l competent cel