动物细胞融合概述.pptVIP

医学细胞生物学设计型实验 实验项目:动物细胞融合  小组成员： 覃 科（1310750171） 张天毅（1310750175） 袁建侠（1310750179） 吴金宝（1310750180） 目录 1、实验目的 2、实验原理 3、实验步聚 4、实验预期结果 5、融合过程观察以及融合率的计算 6、实验试剂及材料 7、注意事项 一、实验目的 1、了解PEG诱导鸡血细胞融合的原理 2、初步掌握细胞融合技术及融合率的计算方法。 动物细胞融合 细胞融合又称细胞杂交，是两个或多个细胞合并形成一个双核或多核细胞的过程。用人工方法诱导细胞融合是20世纪60年代发展起来的新兴技术，发展速度非常快，应用范围极为广泛，已成为广泛，已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤及生物新品种培育的重要手段。 二、实验原理 人工合成形成的融合细胞有两类： 由不同亲本 细胞融合而来 由同一亲本 细胞融合而来 异核体 同核体 3、诱导方式 物理法： 化学法： 生物法： 灭活的病毒 电激、振动、离心 聚乙二醇（PEG） 例如：仙台病毒 目前应用最广泛的是PEG，因为PEG易得、简便，且融合性效果好。PEG可借氢键与H2O结合，高浓度的PEG溶液易使细胞脱水而发生质膜结构变化，导致细胞融合。 灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面 细胞膜被病毒颗粒穿通 细胞膜连接 细胞融合，形成杂种细胞 （细胞膜具有一定的流动性） 4.生物法： 灭活的病毒 （丧失感染性、保留抗原结构） 过程： 细胞融合的应用 搞科研 三、实验步骤 （一）、50%PEG液的制备 根据实验需要，称取一定量的PEG（MV=4000）放入刻度离心管内，用试管夹夹住，在酒精灯焰上加热，使其溶化，冷却至50~60°C时，加入预热的等体积Hanks液混匀，置之37℃水浴箱中保温待用。 实验操作流程 （一）50%PEG液的制备 取一定量PEG放 入刻度离心管内 在酒精灯火焰上 加热使其溶化 待降至50~60°C时 加入预热的等 体积Hanks液混匀 置于37 ℃水浴 箱中保温待用 （二）、融合方法：10%鸡血细胞的制备 1、用肝素钠处理后的注射器，在公鸡翼下抽取2ml静脉血，加入盛有8ml Alsever 液的试管中，使血液：Alsever 液的比例为1:4，混均后可在冰箱中存放一周。 2、取鸡血细胞悬液1ml到10ml离心管，加入9ml 0.85%生理盐水混匀，1000r/min离心5min，弃上清液，再按照上述条件离心洗涤2次。 3、收集沉淀细胞，加入8ml~10ml Hanks液配置成10%的鸡血细胞悬液。 取10%的鸡血细胞 悬液1ml加入离心管中 加入8—10ml Hanks液 倾去上清液， 将离心管倒置于滤纸上 取50%PEG 0.5ml 加入5ml Hanks液混匀 放入离心机中 1000r/min 离心5min 倾去上清液 再次悬浮细胞 离心洗涤一次 手指轻弹 离心管 在37℃水浴中 于1min内逐滴入离心管 加入9ml Hanks 在37℃水浴中静置 5min稀释PEG 齐去上清液 在37℃水浴中 温浴20~30min 加2-3mlHanks液 在5min 10min 20min 30min去悬液制片 用0.2%亚甲基蓝染色 观察 四、预期结果： （一）融合过程观察： 分别于温育5min、10min、15min、20min、30min取细胞悬液一滴制成临时装片，以0.2%次甲基蓝染液染色，在显微镜下观察细胞融合的不同阶段，通常可把融合过程大致分为5个阶段：