蛋白质()讲义.ppt

四、蛋白质的纯度分析 1．溶解度分析 2．电泳法 3．超离心沉降法 4．免疫学方法 5．分光光度法 6．化学分析法 1．溶解度分析 单一蛋白质的溶解度曲线不因加入过量的试样而改变。 如果蛋白质制品是纯的，直线的斜率为1，在折点以后，斜率为零。 不纯蛋白质的溶解度曲线常常呈现两个或两个以上的折点。 溶解的蛋白质量 加入的固体蛋白质的量 2．电泳法 “电泳法”只是一个相对的概念，因为在不同支持物上，电泳分离的效果不一样。 在纸上电泳为一条区带的样本，在聚丙烯酰胺凝胶泳时，可能分成数条区带；如结合等电聚集电泳则更可提高分辩力，很容易检出微量杂蛋白质的混存。 2．电泳法 97.2 66.4 44.3 29.0 20.1 14.3 kDa M 1 3．超离心沉降法 均一分子量的蛋白质其沉淀速度是一致的，因此离心后在溶剂中形成一条明显的分界线。 若为两种分子量不同的蛋白质混合时，则形成二条分界线。 4．免疫学方法 蛋白质往往具有抗原性，用琼脂免疫扩散或免疫电泳法，蛋白质（抗原）与抗血清（抗体）之间可产生沉淀线。 A 琼脂免疫扩散法 5．分光光度法 蛋白质的最大吸收峰在280 nm，核酸在260 nm，若两者比值为1.75以上，表示为纯蛋白质（OD280/ OD 260=1.8）。 是用来检测蛋白质制品中有无核酸混存的方法。 6．化学分析法 应用化学分析方法测定纯化了的蛋白质试样中的某种成分的比值。 总 结 概念： 蛋白质的一级结构、二级、三级、四级 盐析、蛋白质的变性、复性、构象、等电点 1.蛋白质的水解方法有几种，各自优缺点。 2.掌握特殊氨基酸的结构特点、字母符号。 3.α螺旋和β折叠的结构特点。 4.蛋白质沉淀的方法有哪些？各自原理如何？ 5.蛋白质变性的原因、结果和本质是什么？ 总 结 （1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法 ①透析法 ②超滤法 ③离心法 ④凝胶过滤法 （1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法 透析法是利用蛋白质的分子比较大，不能透过半透膜的特点，实现蛋白质与小分子物质分离的方法。 ①透析法 利用一定的压力使样品通过半透膜，这时，小分子和水组成的溶质可以被滤过，而大分子的蛋白质则留在膜内，这种方法称为超滤法，亦称微滤法。 ②超滤 离心分离是利用离心惯性力的作用分离非均相混合物的方法。 由于悬浮液中颗粒的沉降速率不仅取决于颗粒本身的性质，而且也取决于悬浮颗粒介质以及作用在颗粒上的力，因此常采用密度梯度离心法对蛋白质进行分离。 密度梯度离心法是在离心管中通过某种介质来提供一个密度梯度环境，然后加入待分离的物质，通过离心的方法达到分离的目的。 密度梯度离心法 （1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法 凝胶过滤层析也称为分子筛层析，可以对含有不同大小分子的混合物进行分离。 凝胶过滤层析是通过一定的载体来实现的，载体的孔径不同，分离的分子大小范围也不相同。 分离过程是基于蛋白质在自由流动溶剂和存在于多孔凝胶中的固定溶剂间的分配。 ④凝胶过滤法 ④凝胶过滤法 （1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法 利用凝胶过滤层析，除了可以进行混合物的分离外，还能测定样品的相对分子质量。 （1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法 （2）利用溶解度差别的纯化方法 ①溶液的pH会影响蛋白质的溶解度。 ②溶液中的盐离子浓度也会影响蛋白质的溶解度。 ③溶剂的极性同样会影响蛋白质的溶解度。 当溶液的pH与蛋白质的等电点相同时，蛋白质分子呈现电中性，分子间无斥力，分子易于积聚和沉淀，此时蛋白质的溶解度是最小的，这种使蛋白质沉淀的方法称为等电点沉淀。 不同蛋白质具有不同的等电点，利用这一特性，可以通过改变溶液的pH，使要分离的蛋白质沉降出来，这些蛋白质仍然能够保持天然的生物学活性，该方法可以应用于蛋白质的粗分离。 （2）利用溶解度差别的纯化方法 盐离子浓度对蛋白质溶解度的影响随盐离子浓度的不同而不同。低浓度的盐溶液有利于增加溶液中蛋白质的溶解度，这是前面介绍过的盐溶现象。 高的盐离子浓度可以使蛋白质从溶液中聚集沉淀出来，就是盐析现象。 不同蛋白质分子发生盐析所要求的盐离子浓度不同，因此可以通过加入不同浓度的盐来分离不同的蛋白质分子。 硫酸铵经常在盐析中使用，它是一种在水溶液中溶解度大，而且受温度影响比较小的中性盐。 （2）利用溶解度差别的纯化方法 与水混溶的有机溶剂能减少水和蛋白质间的作用力，使蛋白质脱水。 有机溶剂的加入能降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间的作用力增强，蛋白质分子易于聚集沉淀。 （3）根据电荷不同的纯化方法 ①电泳 ②离子交换层析 ①电 泳 电泳是溶液中带电粒子（离子）在电场中移动的现象。利用带电粒子在电场中移动速度不同而使目标分子分离的技术称为电泳技术。 在一定的pH溶液中，蛋白