21DNA重组的载体蓝背景222课程.ppt

重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119 pUC118：pUC18 + M13间隔区 IG pUC119：pUC19 + M13间隔区 IG 500 个拷贝 3200 bp MCS lacZ’ lacI ori Apr M13-MG pUC118 / 119 表示M13辅助噬菌体DNA 重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体 pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7 2958 bp MCS lacZ’ PT7 ori Apr f1-ori pBluescript PT3 噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的 转录，提取出来的单链DNA重组分子 在噬菌体RNA聚合酶的存在下，又可 实现外源基因的体外转录。 2.1.5人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能 细菌人造染色体（BAC） 酵母人造染色体（YAC） 满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体 那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。人造染色体载体包括： 细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上 构建的，命名为pBACs，其装载量范围在50 - 300 kb之间。各 种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝。 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） YAC载体一般含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为350-400 kb。 酵母人造染色体的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TEL BamHI TEL ori Apr TRP ARS EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 连接 转化酵母菌 重组酵母染色体 质粒的基本特征 4.携带特殊的遗传标记： 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。 2.1.1.2质粒的构建 原因：天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大 多是由少数几个野生型质粒构建而成的： pSC101 8.8 kb，拷贝数 5，四环素抗性标记基因 Tcr ColE1 6.5 kb，拷贝数 20 - 30，大肠杆菌内毒素标记基因 E1 RSF2124 ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因 Apr 改造的原则 （1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的相对分子质量 （2）灭活某些质粒的编码基因，应为非转移性质粒，应为松弛型质粒 （3）加入易于识别的选择标记基因 （4）引入具有多种限制性内切酶的单一识别位点 （5）根据外源基因克隆的不同要求，加装特殊的基因表达调控元件 构建过程（P14） 2.1.1.3质粒的分类 人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-3000，扩增基因 低拷贝质粒 来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因 温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质 测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头（polylinker） 整合质粒 装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合 穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆 表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件 探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选 重要的大肠杆菌质粒载体 松弛型复制 pBR322： 氯霉素可扩增 拷贝数 50 - 100 / cell 用于基因克隆 pUC18 / 19： 拷贝数