第六章重组体的筛选与鉴定综述.pptVIP

* 第六章 重组体的筛选与鉴定 将目的基因与载体连接形成重组子,然后通过各种方法将重组子导入宿主细胞,得到所需要的带有重组DNA的转化子是基因工程的目的所在. 何谓转化子? 所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞. 为什么对重组子要进行鉴定筛选? 在转化反应中,并非所有的细胞中都转入重组DNA分子,即使所有的受体细胞都变为转化体,所获得的转化子仍是多种类型的DNA分子,原因是在连接反应中会有以下几种情况发生: 载体和一个或数个串联目的基因连接 载体发生自连 目的DNA分子发生自连 未发生连接反应的载体和目的DNA片段(更多) 为什么对重组子要进行鉴定筛选? 因此,在成千上万个转化子中，真正含有期望的重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA的宿主细胞分开，以及将含有正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开，就需要设计出最易于筛选重组子克隆的方案并加以验证。 常用的重组子筛选和鉴定方法 重组子大小的鉴定(质粒DNA的快速提取鉴定) 重组子酶切图谱鉴定(限制性核酸酶酶切片段 大小鉴定) DNA序列分析 同源性分析鉴定(原位杂交) 质粒载体的抗性标记筛选 噬菌体包装容量的正性筛选 质粒载体的α互补筛选(蓝白色斑筛选法) 标记补救筛选 翻译产物(Western blot) 转录产物(Norther blot) 其他方法(报告基因) DNA 鉴定 载体 筛选 直接 筛选 间接 筛选 重组 子的 筛选 第一节 遗传学检测法 一、根据载体表型特征的筛选 根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是一种比较简单而又十分有效的方法。在基因工程中使用的所有载体分子,都至少含有一个选择标记。质粒常有抗生素抗性基因,如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tetr）、卡那霉素抗性基因（Kanr）根据载体分子所提供的选择性标记进行筛选,是获得重组体DNA分子必不可少的条件之一。 在实际操作中,最典型的方法是使用抗药性标记的插入失活作用,或是β-半乳糖苷酶基因的显色反应,将重组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来.而对于λ噬菌体的置换型载体来说,λ噬菌体头部外壳蛋白容纳DNA的能力是有一定限度的。其包装能力应控制在野生型λDNA长度的75%-105%之间（36-51kb），这样才能形成噬菌斑。因此，包装限制这一特性，保证了体外重组所形成的有活性的λ重组体分子，一般都应带有外源DNA的插入片段，噬菌斑的形成本身就是λ重组体的一种筛选特征。由于这些方法都是直接从平板上筛选，所以又称为平板筛选法。 一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 1.以pBR322质粒为例 （1）pBR322质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别位点。 一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 1.以pBR322质粒为例 （2）筛选重组体的原理 在Ampr和Tetr这两个基因内的任一插入作用，都会导致Ampr基因或Tetr基因出现功能性失活，于是，所形成的重组质粒都将具有AmpsTetr或Amprtets的表型。 当外源DNA片段插入pBR322质粒DNA的BamHⅠ或SalⅠ位点时，抗四环素基因失活（Tetr Tets ），重组体转化子必定具有AmprTets表型。因此，将转化菌先涂布在含有Amp的琼脂平板上，并将存活的Ampr菌落原位影印到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Amp平板上生长，而不在Tet平板上生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA片段的重组质粒转化子克隆. 如下图所示 同样,在pBR322质粒的Ampr基因序列中,利用PstⅠ 限制性核酸内切酶识别位点,插入外源DNA片段,也 能应用插入失活作用检测重组质粒,当然,所挑选 的菌落就应该是具有AmpsTetr的表型 一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 pBR322 pBR322 pBR322 Ampr Tetr AmprTetr AmprTets + 菌落原位影印 Amp琼脂平板 Tet琼脂平板 图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体 一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 1.乳糖操纵子的结构 阻遏蛋白 β-半乳