免疫染色方法课程.ppt

HRP-F1McAb 免疫染色检查鼠疫菌试验甘肃省疾病预防控制中心张 宏 内 容 一、材料 二、试验方法 三、报告检验结果 一、材 料 （一）试剂 1. HRP-FIMcAb（辣根过氧化物酶标记F1抗原单克隆抗体）：用PBS.T配制，常用应用浓度一般为ELISA法应用浓度的2-3倍。 2. 固定液：柠檬酸0.5g，溶于75% 乙醇100ml，30% H2O2 5ml，具有杀菌、固定标本和消耗内源性酶活性三项作用。 3. 稀释洗涤液：0.01M pH 7.2 PBS，含吐温-80 0.05%、小牛血清2 %，升汞（HgCl2）0.5 %。 4. 底物染色液 Kaplows染液：30%乙醇100 ml，联苯胺-2HCI 0.3g，3.8 % ZnSO4·7H20 1ml，NaC2H3O2·3H2O 1.0g ，1N NaOH 1.5ml，沙黄O.02g，按顺序每加一种试剂，充分振荡使其溶解或充分混匀，pH调至 6.0，过滤后装在棕色瓶内，室温可长期保存。临用前取1 ml加3% H2O2 0.05m1。 （二）器材 1. 普通光学显微镜。 2. 载玻片（盖玻片）：经清洁液处理过。 二、试验方法 （一）标本制备与涂片 1. 采取标本：按强毒操作程序进行，留足细菌学检验标本，及时编号记录。 2. 细菌培养物制片： （1）液体培养，蘸取菌液，直接涂片。 （2）菌落，用白金耳蘸取菌落，加稀释洗涤液研成菌液，涂片。 3. 脏器或组织标本制片 （1）压印标本：组织切面轻轻在载玻片上压印。 （2）剪碎并研磨成糊状，加等量稀释洗涤液研 磨3分钟，移入试管，用等量稀释洗涤液冲 洗乳钵，移入试管，盖胶塞后摇匀。 （3）试管外部用消毒液浸泡后，可从强毒实 验室移到弱毒实验室。 （4）组织悬液差速离心集菌涂片：组织悬液 500g离心5分钟，取上清经3000g离心5分钟 后，取沉淀涂片。可提高阳性检出率。 4. 标本涂片自然干燥。 （二）酶免疫染色 1. 对照：同步做阴性、阳性标本对照。 2. 固定：用固定液固定10分钟，流水冲洗1分钟。 3. 与酶标记物反应：加HRP-FIMcAb，置湿盒内，室温作用30分钟。 4. 冲洗：流水冲洗1分钟。 5. 显色：用Kaplow染液染色5分钟，流水冲洗。 6．观察记录结果：光学显微镜油镜检查 （1）标本染色结果必须与己知阳性、阴性对照 相符。 （2）按目测染色深浅与着染菌体量分级: 镜检：无色或仅见微弱染色，染色浅、明显可 见，染色清晰，染色浓厚。 按镜检染色清晰菌体量分级：未看到（-），平均 每视野有1-5个（+），每视野5个以上（++）， 满视野（+++）。 三、报告检验结果 （一）逐项填写报告单。 （二）检验结果格式 1. 检验方法名称：HRP-F1McAb免疫染色检查鼠疫菌试验 2. 检验结果： 检出酶免疫染色阳性杆菌（+）或（++） 未检出酶免疫染色阳性杆菌（-） 3. 检验者：2人或2人以上签名 4. 报告时间：__年__月__日__时 HRP-F1McAb 免疫荧光染色检查鼠疫菌试验 内 容 一、试剂 二、器材 三、操作方法 四、观察记录结果 一、试 剂 1．FITC-FIMcAb：异硫氰酸荧光黄标记鼠疫F1单克隆 抗体。临用前按说明书配制应用 液。 2．固定液：75%乙醇 3．稀释洗涤液：PH 7.2 0.01M磷酸盐缓冲液（PBS） ，含升汞0.5%，小牛血清1%。 4．封固剂：甘油和 0.5M pH9.O-9.5 碳酸盐缓冲液 的等量混合液。 5．镜油、二甲苯、擦镜纸等。 二、器 材 1. 荧光显微镜。落射型光源对眼睛损害较小。 2. 载玻片（厚度0.8～1.2mm）；盖玻片（厚度 为0.17 mm左右）。 三、操作方法 （一）标本制备与涂片 （与酶免疫染色法相同） （二）荧光染色 1．设置对照：同步做阴性、阳性标本对照和 自发荧光对照。 2．固定、杀菌：用75%酒精固定标本10分钟， 酒精亦起到杀菌作用。流水冲洗。 3．浸洗：含1%牛血清PBS浸洗标本5分钟。 流水冲洗。 4. 荧光染色：加FITC-FIMcAb适量（0.2ml）， 室温作用30分钟，流水冲洗。 5. 干燥：用滤纸吸去水珠，自然干燥。 （三）观察记录结果 1. 荧光显微镜油镜