基因克隆载体重点.ppt

第三章 基因克隆载体(质粒载体) 载体 (P39) 概念：携带外源DNA进入宿主细胞，并为其提供复制和功能基因表达调控系统的工具。 功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件 载体在基因工程中的必要性 目的外源DNA很难进入受体细胞 目的外源DNA一般不带复制子系统 目的外源DNA一般不具备表达的调控系统 载体应具备的条件（P38） 1. 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3. 具有多种单一的酶切位点（多克隆位点）4. 具有合适的选择性标记 自我复制表达，外源基因的插入不影响其功能的发挥，易于从宿主细胞分离出来 5. 分子量尽可能小，以提高其载装能力 目的基因能否有效导入受体，并在其中高效表达，很大程度上取决于所用的载体。 质粒的基本生物学特征 生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并稳定遗传的一类核酸分子 常见于原核细菌和真菌中 绝大多数的是DNA型（除了酵母的杀伤质粒（killer plasmid）是一种RNA质粒外） 绝大多数具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA 分子量范围：1－300kb，多数在10kb 某些蓝藻、真菌和绿藻中也有发现 质粒的存在形式： 开环DNA分子(oc-DNA) 线性DNA分子(l-DNA) 超螺旋DNA分子(scDNA) 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。 质粒DNA的复制 质粒拷贝数即一个细胞内质粒的数量与染色体数量之比。每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 质粒的不相容性（P39） 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞内稳定的共存。 质粒的不相容性：分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。 一、 质粒载体 质粒克隆载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体。 天然质粒的缺陷 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 （1）分子量大，拷贝数低 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。 （2）筛选标志不理想 ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。 colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。因此可通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞……. 3.2 构建质粒克隆载体的基本策略 能在受体中进行有效的复制（有复制起始位点）。 含多克隆位点 含有供选择克隆子的标记基因，如：常用的标记基因：Apr，Kmr，Smr， Tcr基因等 DNA分子尽可能小和较高的拷贝数。 根据特殊需要，组装各种“元件”，构建不同用途的质粒克隆载体。 理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。 3.3 质粒克隆载体的构建 (P39) 选择合适的出发质粒 正确获得构建质粒克隆载体的元件 组装合适的选择标记基因 选用合适的启动子 构建过程力求简单 出发质粒（亲本质粒） 亲本质粒必须含有质粒克隆载体必备的元件： 复制起始位点 选择标记基因 克隆位点 启动子和终止子 组装合适的选择标记基因 绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记 不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。 当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。 合适的启动子 真核生物基因在原核生物中表达，改用原核生物或病毒（噬菌体）基因的启动子。 原核生物基因在真核生物中表达，仍用原核生物基因的启动子。 选用外界条件诱导的启动子。 (1) 质粒克隆载体pBR322 pBR322是经人工改造的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，应用广泛。现在已经被许多更优良的新型克隆载体所替代。 (P40) pBR322