生化实验技术专题重点剖析.pptVIP

生化实验技术专题 目录 第一节 生物大分子物质的制备 生物大分子分离纯化的一般步骤 几种主要沉淀方法比较 调整硫酸铵溶液饱和度计算表 注意事项 第二节 几种重要的生物化学实验技术 一．层析技术（chromatography） 层析技术原理 层析法分类（按装置分类 ） 氨基酸分析仪图解 层析法分类及原理（按分离原理分类 ） 各类层析的原理和载体 吸附层析（absorption chromatography） 分配层析 分子筛层析（gel-filtration chromatography） 离子交换层析（ion-change chromatography） 亲和层析（affiuity chromatography） 聚焦层析（Chromatofocusing） 几种主要层析方法比较 二 、 电泳技术 电泳的一般原理 电泳技术分类（按实验装置分类） 常用电泳技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） SDS 等电点聚焦（isoelectric focusing） 免疫电泳immunoelectrophoresis 毛细管电泳 毛细管电泳装置示意图 三、 离心技术 超速离心机工作原理图解 沉降系数（S） 生物分子的检测 高压电源 光源 光电倍增管 数据采集 毛细管 缓冲液-样品 缓冲液 1．离心机类别 普通离心机 ?6000转/分 高速离心机 2-3万转/分 超速离心机 ?3万转/分 2．沉降系数（S）概念 3．超离心法类别 沉降速度法（sedimentation velocity） 沉降平恒法（sedimentation eguilibrium） 光源 转轴 转头 样品池 光学系统 液面 沉降界面 沉降物质 平衡池 沉降界面峰 浓度对距离的图谱 生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。? 沉降系数（S）与分子量（M）的关系 M = RTS D(1-??) Svederg方程: * * 主要内容和要求：以蛋白质分离纯化为例介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和注意事项；介绍层析技术、电泳技术、离心技术的原理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法。 第一节 生物大分子物质的制备 第二节 几种主要的生物化学实验技术 第三节 生物分子的检测 一．一般过程 二．注意事项 三．纯化方案的设计和评价 例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 材料的选择和处理 确立测定方法 细胞的破碎 有效成分的抽提 有效成分的浓缩 层析法 电泳法 超离心法 超滤 盐析（硫酸铵盐析） 等点电沉淀 有机溶剂沉淀 透析 │←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│ 材料选择与处理 细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理） 生物组织→无细胞提取液→粗产品→ →结晶 1．控制适当的pH 2．控制低温 3．注意提取过程中的溶液环境 4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基 一、层析技术 二 、电泳技术 三 、离心技术 1．层析技术一般原理 2．层析技术分类及应用 层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。 样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示： ? 样品原点到斑点中心的距离 Rf= —————————————— 样品原点到溶剂前沿的距离 纸层析 薄膜层析 柱层析 洗脱液 样品 填充物 分部收集 玻璃柱 缓冲液泵 显色反应管 茚三酮泵 已分开的氨基酸 离子交换柱 样品注入口 记录仪 光电倍增管 光源 吸附层析 分配层析 凝胶过滤（分子筛层析） 离子交换层析 亲和层析 聚焦层析 类别 分离原理 基质或载体 吸附层析 化学、物理吸附 硅胶、氧化铝 、羟基磷酸 分配层析 两溶剂相中的溶解效应