实验ELISA法测定乙肝重点剖析.ppt

实验七 ELISA法测定乙肝 ：是指用可微量测定的标记物（放射性核素、荧光素、酶等）对抗原或抗体进行标记，并在标记免疫物质反应结合后，测定结合物中的标记物来反映抗原-抗体反应的检测技术。 目前最常用的是酶标记免疫技术、荧光标记免疫技术、放射性核素标记技术。这类免疫标记技术的应用极大程度地提高了抗原-抗体反应的检测敏感性。 酶标记免疫技术 以酶作为标记物，通过显色反应指示抗原-抗体反应的标记技术称为酶免疫技术。 可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定技术两大类。目前应用最广的为酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）,是免疫测定技术的代表。 乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒 测定原理： 采用单克隆抗-HBs（ HBs Ab）包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗HBs-HRP（辣根过氧化物酶）,当标本中存在HBs Ag时，该HBs Ag与包被抗-HBs结合并与抗HBs-HRP结合形成抗-HBs- HBs Ag-抗HBs-HRP复合物，加入显色TMB（四甲基联苯胺）底物产生显色反应，反之则无显色反应。 试剂盒组成： 1.包被好的微孔反应板 2.酶结合物 3.阳性对照 4.阴性对照 5.洗涤液 6.显色剂A、B 测定步骤 1.每孔加入待测样本50μl，设阴性、阳性对照孔，每孔加入阴性对照（或阳性对照）各一滴，并设空白对照1孔。 2.每孔加入酶结合物一滴（空白对照孔除外），充分混匀封板，置37℃孵育30分钟。 3.手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。洗板机洗板：选择5次程序洗板后拍干。 4.每孔加入显色剂A、B液各一滴，充分混匀，封板，置37 ℃孵育15分钟。 5.用酶标仪读数，取波长450nm,先用空白孔较零，然后读取各孔OD值。 结果判断： 判断为阳性，否则为阴性。 阴性对照OD值低于0.05时作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。 胶体金技术（金标法） 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H 则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。  胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。  免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。 * 酶联免疫吸附试验 （ELISA） 掌握酶联免疫吸附试验的原理、方法和结果判断及临床应用。 实验目的： 将抗原（或抗体）结合于某种固相载体的表面，并保持免疫活性，再以标本中的待检抗体（或抗原）与之结合，然后使酶标抗体与已形成的抗原抗体复合物结合，分别洗去未结合的抗原与抗体，最后加入酶反应的底物，出现呈色反应，该反应中的有色产物含量与待检抗体（抗原）的含量直接相关。 实验原理： ELISA测定方法有： 间接法：检测抗体最常用的方法； 双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法； 竞争法：既可用于测抗原，又可用于测抗体； （1）间接法测定抗体 A. 将抗原吸附于固相载体表面(试剂盒生产厂家已经做好）； B.加抗体, 形成抗原-抗体复合物?; C.??加酶标抗体（多为37℃孵育） ； D.洗液洗去多余?未结合酶标抗体 E.加底物,显色反应， 测定底物的降解量和抗体量有关。 （2）双抗体夹心法测定抗原 A.????? 将抗体吸附于固相表面; B.????? 加抗原，形成抗原-抗体复合物; C.???? 加酶标抗体; D. 洗液洗去多余?未结合酶标抗体 E. 加底物显