食品中菌落总数和大肠菌群的检测课程介绍.ppt

　　我国和许多国家的大肠菌群检验结果均采用大肠菌群MPN来表示，2003标准采用每100ml（g）样品中大肠菌群最近似数来表示，2008\2010标准采用每1mL(g)样品中大肠菌群最近似数表示。 　　MPN值是按一定方案检验结果的统计数值，这种检验方案，在我国GB/T4789.3-2010 中将过去的“采用样品三个稀释度各三管的乳糖发酵三步法”修改“两步法”。 GB/T5009.3-2010 食品安全国家标准食品微 生物学检验 大肠菌群计数 ——修改了标准的中英文名称； ——“第二法大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15 CFU～150 CFU”； ——删除了“第三法大肠菌群PetrifilmTM 测试片法”。 二、 细 菌 学 检 验 程序----大肠菌群 GB 4789.3-2010 GB 4789.3-2003 3.设备和材料 3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 3.4 天平：感量0.1 g。 3.5 均质器。 3.6 振荡器。 3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 3.9 无菌培养皿：直径90 mm。 3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 3.11 菌落计数器。 4.培养基和试剂 区别：培养基pH值（4.1: 6.8±0.2; 4.2: 7.2±0.1; 4.3: 7.4±0.1；4.4: 7.2） 灭菌温度（121℃/15min） 4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤： 见附录A 中A.1。 4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤： 见附录A 中A.2。 4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）： 见附录A 中A.3。 4.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。 4.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。 4.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。 4.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓 冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min,或放入盛有225 mL 磷酸 盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋 中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓 冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中， 充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 6 操作步骤 6.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。 6.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。 6.2 初发酵试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤/乳糖胆盐发酵管，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 2003版增加-分离培养:伊红美蓝琼脂平板(36℃±1 ℃, 24 h±2 h) 操作示意图 1mL 1mL 1mL 10-1 10-2 10-3 10-4 10mL 10mL 10mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 空白 S1 S2 1mL 1mL 1mL 灭菌生理盐水 双料 复发酵 (BGLB/乳