DNA文库的构建和目标基因的筛选.ppt

2、第一链cDNA的合成 由mRNA到cDNA的过程称为反转录，由反转录酶催化。 反转录酶： AMV和Mo-MLV。 合成DNA是需要引物引导： oligo(dT)引物；随机引物。 3、 TAP法构建全长cDNA文库 Invitrogen公司的试剂盒原理，首先利用碱性磷酸酶处理使非全长mRNA无效化。用烟草酸焦磷酸酶处理以移去全长mRNA的帽子结构，然后为脱帽后的全长mRNA的5’末端接上人工接头，利用具oligo(dT)的人工接头进行反转录，得到的全长cDNA第一链的两端就打上了特别设计的人工接头，可用PCR法对全长总cDNA进行放大，酶切后与载体连接。 * 六、其它cDNA文库 表达cDNA文库： 用表达载体构建全长cDNA文库，文库的每一个克隆子可以表达出蛋白，利用蛋白对克隆子进行筛选。 双杂交全长cDNA文库： 将表达文库与酵母双杂交系统结合使用，利用酵母作宿主，通过融合蛋白的酵母双杂交对克隆子进行筛选，用于鉴定可与特定蛋白相互作用的基因，主要为转录因子。 重组酶克隆策略的cDNA文库： 将重组酶的特异识别序列attP1和attP2构建到每个cDNA的两端，在非消化情况下实现与载体的重组连接，避免了基因被切断。 * 第三节 基因克隆的筛选策略 大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成，从其中筛选分离出某一个特定基因并不是件简单的事。 一、表型筛选法 一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以赋予宿主特定的表型，可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法等）直接筛选，宿主多为突变体。 * 二、杂交筛选和PCR筛选 1、杂交筛选 * 2、PCR筛选法： 将文库贮存于多个96或384孔板中，首先通过PCR确定目标基因所在的特定PCR板(主混合池筛选)，然后通过PCR确定目标基因在特定PCR板上的特定行和列(行混合池筛选和列混合池筛选)，最后通过逐个克隆的PCR确定目标基因所对应的克隆子。 * 三、免疫筛选 首先制备和纯化得到目标基因的抗体，然后利用抗体来筛选目标基因所在的表达文库，得到目标基因所对应的克隆子。 方法有原位检测和免疫沉淀检测。 1、原位检测法 滤膜（固定抗体） + 2、免疫沉淀检测法 菌落 沉淀素 * 四、酵母双杂交系统(yeast two hybrid system) 酵母双杂交：研究蛋白与蛋白相互作用，主要为转录因子之间的互作。 转录因子(如酵母的GAL4)一般具有两个结构域：DNA结合域(DNA binding domain, BD)和激活结构域(activation domain, AD)。 已知蛋白X与BD融合(BD-X，诱饵, bait)，未知蛋白Y与AD融合(AD-Y，猎物, prey)，当X与Y存在互作时，BD与AD接近并启动报告基因转录表达，否则不表达。 酵母的双杂交系统示意图 * 五、克隆基因的验证和分析 阳性克隆的鉴定方法： 1、酶切指纹图谱 2、Southern杂交 3、二次杂交 4、体外表达蛋白 5、DNA序列分析 * 第四节 DNA文库的保存 文库的长期存在-80℃进行。 噬菌体文库的保存：繁殖一次，分成若干小份，加2%至3%的氯仿可在4℃下保存数月，或加7%的DMSO长期保存于-80℃。 落菌文库的保存：甘油贮存克隆子的菌液于-80℃。 文库阵列法：保存大片段文库。 引导合成法合成第二链cDNA * 洛阳师范学院生命科学系 韩建明 基 因 工 程 上章要点回顾 1、Maxam-Gilbert化学降解法 2、Sanger双脱氧链终止法 第十一章 DNA文库的构建和目标基因的筛选 基因文库(gene library)： 指某一生物分离的全部基因的集合。 基因组DNA文库： 指将是指某个生物的基因组DNA与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，通过筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。 cDNA文库： 指某生物某一发育时期、某一组织或某种环境条件下所转录的mRNA经逆转录形成的cDNA片段与载体连接转化受体细胞而形成的克隆的集合